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分段负义 RNA 病毒(Segmented negative-sense RNA viruses,sNSV)普遍采取“抓帽机制”来合成含帽子结构的信使RNA(mRNA),即它们从寄主mRNA抓取一段10-20个碱基的帽子序列,然后以这段帽子序列为引物,转录自身基因组,生成在5’端含一段“异源”帽子序列的病毒mRNA。水稻条纹病毒(Rice stripe tenuivirus,RSV)是一种重要的植物sNSV。近年,本实验室建立了一种高通量测序技术,可以方便且低成本地测取RSV抓取的帽子序列。番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)依靠寄主转录系统合成自己的mRNA。虽然已知TYLCV基因组含6个开放阅读框(ORF),但寄主从TYLCV基因组的哪些位点起始转录,即TYICV的转录起始位点(Transcription start sites,TSS),目前还不清楚。本研究尝试利用RSV的“抓帽”解决这一问题:即以RSV抓取TYLCV mRNA的帽子序列(帽子序列5’端第一个碱基即为TYLCV的转录起始位点),然后以高通量测序技术获得这些帽子序列。首先,通过条件摸索,本研究建立了一种方法,可以稳定地获得RSV与TYLCV共侵染的本氏烟(Nicotianabenthamiana):以RSV侵染的水稻叶片为起始材料,通过摩擦接种的方式将RSV接种到5-7叶期的本氏烟;室内培养10天后,以TYLCV侵染性克隆接种RSV感染的本氏烟;再过15天后,分别提取接种植物的总RNA,以RT-PCR检测TYLCV和RSV。接着,本研究取RSV和TYILCV共侵染,或RSV单独侵染的本氏烟(阴性对照),以高通量测序技术测取了 RSV NCP mRNA的帽子序列,分别获得帽子序列库1(混合侵染)和库2(单独侵染)。分析表明,库1含帽子序列共715,896条,unique帽子序列11,833条;其中,与TYLCV基因组完全匹配的帽子序列共12,599条,unique帽子序列30条;将这些帽子序列Map到TYLCV基因组,获得TYLCV转录起始位点21个,其中,TYLCV病毒链9个,反义链12个;每个转录起始位点Map到的帽子序列最多的2075条,最少的4230条,平均419.97条。库1中能Map到TYLCV的帽子序列,仅有49条(4个unique)也存在于库2中,这表明多数Map到TYLCV的帽子序列来自TYLCV mRNA,而非寄主mRNA。上述结果表明RSV的“抓帽”可以作为一种工具,鉴定TYLCV的TSS。为验证所得结果的可靠性,本研究接着利用传统的RLM-RACE技术研究了 TYLCV AV2和AC3(AC2)ORF上游的转录起始位点。结果表明,RLM-RACE方法可以获得的转录起始位点,尤其是那些常用转录起始位点,多数可以利用“抓帽”获得;而利用“抓帽”获得的转录起始位点,多数可以通过传统的RLM-RACE进行验证。但是,与传统的RLM-RACE实验相比,“抓帽”具有明显的优势:(1)不必针对每条mRNA设计和筛选不同的引物;(2)TYLCV所有转录起始位点可以通过一次高通量测序反应获得;(3)在所得信息量相同的条件下,“抓帽”比传统的RLM-RACE实验花费低很多。“抓帽机制”研究已有近40年的历史,本研究首次探索该机制的应用。作为一个类群,sNSV具有很广的寄主范围。从理论上讲,按照类似于本研究的方法,只要某一病毒可以和任意一种sNSV共侵染,该病毒所有的转录起始位点就可以一次性获得。因此,本研究建立了一种十分有效且有较大应用潜力的方法;另外,由于TYLCV极易进行遗传操作,RSV和TYLCV的共侵染也为进一步解析RSV的抓帽机理提供了一个有用的研究体系。