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背景乳腺癌是严重威胁全世界女性健康的恶性肿瘤之一。不论其发病率还是死亡率在中国女性常见恶性肿瘤中均位居前列。近年来乳腺癌的发病年龄越来越趋于年轻化,基于放疗、化疗、内分泌治疗和分子靶向药物治疗等多学科联合治疗的发展,虽然早期乳腺癌的治疗效果已得到改善,但其恶性进展仍未取得完全有效控制。免疫治疗是目前肿瘤治疗界有望弥补传统治疗方法不足的新兴领域,机体免疫机制是影响肿瘤发生发展的关键步骤,其中细胞毒性T淋巴细胞（Cytotic T Lymphocyte,CTL）是对肿瘤细胞产生杀伤作用的主力,其关键在于CTL能识别肿瘤表面因基因突变产生的特异性新抗原,而肿瘤特异性新抗原能够被CTL识别,又需要人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）的抗原呈递功能。HLA-A0201是HLA-A亚型中的一种,其在中国人群中占有约13%的较高比例。目前学界研究的主要难点在于对肿瘤特异性新抗原的识别和鉴定。因此肿瘤免疫细胞治疗研究亟待解决的是利用一种快速、有效的方法寻找能诱导特异性CTL杀伤肿瘤的新抗原,这将是治疗包括乳腺癌在内的恶性肿瘤的新希望。目的本研究的目的在于通过生物信息学预测技术结合免疫学实验方法快速有效地鉴定出乳腺癌中能够诱导特异性CTL应答的新抗原,为乳腺癌的肿瘤免疫治疗提供有效的新靶点并奠定研究基础。方法1.运用数据库癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）,国际癌症基因组协会（International Cancer Genome Consortium,ICGC）和Nature文献中关于乳腺癌的单核苷酸变异（Single nucleotide variations,SNVs）数据,利用生物信息技术结合亲和力预测软件预测乳腺癌中HLA-A0201限制性新抗原表位并进行化学合成。以T2细胞进行肽结合实验检测候选新抗原肽结合亲和力和稳定性,优化筛选高亲和力新抗原肽。2.从健康志愿者外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中分离CD8+T细胞和树突状细胞（Dendritic cell,DC）。利用细胞因子GM-CSF、IL-4、IFN-γ和CD40L诱导DC细胞分化成熟,然后将DC负载高亲和力新抗原肽并与CD8+T细胞共培养,刺激、诱导产生特异性CTLs并收集。3.免疫原性验证以酶联免疫斑点实验（Enzyme-linked immunospot,ELISPOT）检测经负载新抗原肽的DC刺激CD8+T细胞产生特异性CTLs的效能;以LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测（Lactic Dehydrogenase,LDH）试剂盒测定负载新抗原肽的DC细胞诱导产生的特异性CTLs的杀伤活性效果。4.经筛选得到来源于TWISTNB130-138编码的新抗原肽通过ELISPOT实验来研究其突变型和野生型肽是否会产生交叉免疫反应。并检测稳转TWISTNB130-138基因的HCT116癌细胞表面能否呈递TWISTNB130-138新抗原肽,且被TWISTNB130-138抗原肽诱导的特异性CTLs所识别。5.扩大健康志愿者样本通过ELISPOT实验检测TWISTNB130-138新抗原肽致敏的DC细胞是否均能够诱导特异性CTLs产生。结果1.通过生物信息技术结合6种亲和力预测软件成功预测出HLA-A0201限制性9肽,并根据亲和力评分和新抗原肽突变频率筛选出30条乳腺癌新抗原表位肽并成功进行人工合成。2.采用肽结合实验,以负载新抗原肽的T2细胞为靶细胞优化新抗原表位肽。结合筛选标准成功优化出10条新抗原表位肽序列,分别为:RHO261-269（FLMCWVPYA）、SLC13A3375-383（FLYDAVTGV）、PIK3CA451-459（GLKDLLNPI）、CLN3120-128（YLLPYSPRV）、PIK3CA338-346（ILCATYVKV）、MRGPRX4225-233（FLLCGLPFV）、COL14A11035-1043（FMVDGFWSI）、TWISTNB130-138（KLMGIVYKV）、CCNA2213-221（ILVDWLFEV）和CDC37L1196-204（YLILWCFYL）。3.以ELISPOT实验检测10条新抗原肽体外诱导特异性CTLs的能力。除RHO261-269、CLN3120-128和CCNA2213-221外,其余7条肽刺激的CTLs形成的IFN-γ斑点数与无关肽组相比显著升高。其中,TWISTNB130-138刺激的CTLs形成的IFN-γ斑点数为565±9.19,约5.65%（565/10000）的CTLs分泌IFN-γ,与无关肽组比较升高了约25.7倍（p<0.001）。4.在细胞毒性检测实验中,TWISTNB130-138、PIK3CA338-346、COL14A11035-1043、SLC13A3375-383和CDC37L1196-204 5条新抗原肽诱导产生的特异性CTLs分别对负载相应抗原肽的T2靶细胞产生杀伤活性,效应细胞和靶细胞的比例从1:1升到10:1时,特异性杀伤百分比平均值分别升高34.7%、11.73%、12.63%、9.77%和9.10%,TWISTNB130-138组杀伤活性最显著。5.ELISPOT结果显示以TWISTNB130-138突变型肽诱导的特异性CTLs被突变型肽致敏的T2细胞刺激时产生的IFN-γ斑点数远高于野生型肽和无关肽致敏的T2细胞组（P<0.01）。而以TWISTNB130-138野生型肽诱导的特异性CTLs被突变型肽致敏的T2细胞刺激时产生的IFN-γ斑点数低于野生型肽致敏的T2细胞,且与无关肽致敏的T2细胞组结果相似。6.ELISPOT实验结果显示TWISTNB130-138突变肽特异性CTLs在被稳定表达TWISTNB130-138突变基因的HCT116细胞刺激时产生的阳性斑点数远高于被HCT116细胞刺激时产生的斑点数（P<0.01）。7.TWISTNB130-138突变肽分别在另外7个健康志愿者中通过ELISPOT实验进行免疫原性验证,结果显示TWISTNB130-138突变肽刺激7例健康志愿者来源的特异性CTLs形成的IFN-γ斑点数与无关肽组相比显著升高（P<0.05）。结论1.经负载HLA-A0201限制性TWISTNB130-138、PIK3CA338-346、COL14A11035-1043、SLC13A3375-383和CDC37L1196-204多肽的DC刺激后,在体外能够有效活化和扩增特异性的CTLs,这些CTLs对负载对应多肽的T2靶细胞产生杀伤活性。2.成功鉴定一条新抗原突变多肽TWISTNB130-138,其能够诱导产生特异性CTLs,且可能与TWISTNB130-138野生型肽产生交叉免疫反应。3.来源于TWISTNB130-138的突变肽能够被呈递在HLA-A0201限制性HCT116肿瘤细胞上,并能够被TWISTNB130-138诱导产生的特异性CTLs所识别。4.来源于TWISTNB130-138的突变肽可在不同健康志愿者体外诱导特异性CTLs。5.通过使用数据库中现有的测序数据结合生物信息新抗原预测技术和健康志愿者体外免疫细胞实验验证,可快速及有效的筛选出乳腺癌新抗原,为乳腺癌肿瘤免疫细胞治疗提供研究基础,也为更多肿瘤新抗原的识别提供有效途径。