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背景:OSW-1是一种甾体皂苷,于1992年由Kubo等人首次从虎眼万年青球茎中分离得到。近30年来,OSW-1的合成及其构效关系一直是研究的热点。近年来,随着OSW-1及其衍生物合成工艺的改进,关于OSW-1作用机制的研究也逐渐增多,许多临床前研究证实了其对不同癌细胞的特殊抑制活性。尽管如此,OSW-1的抗癌机制仍不明确,这限制了其进一步临床应用。据报告,OSW-1对胶质瘤U87-MG细胞表现出极其强效的细胞毒性活性,IC50值在纳摩尔浓度（0.047 n M）,表明它是一种有前途的抗胶质瘤药物。胶质瘤约占所有脑肿瘤的26%,是最常见的原发性颅内恶性肿瘤,占82.4%。根据肿瘤来源的胶质细胞类型,胶质瘤可分为多种特定的组织学亚型。尽管并非所有类型的胶质瘤都表现为恶性,但胶质瘤通常预后不良,尤其是高级别胶质瘤,它们的生存期非常短、复发率高且死亡率高。胶质瘤以广泛侵袭性生长为特征,使得完全手术切除困难。目前,术后替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）化疗联合放疗是胶质瘤的一线治疗方式。然而,治疗结果仍不令人满意,主要原因是TMZ易发生耐药。据报道,至少50%接受TMZ治疗的患者对TMZ治疗无应答,且多种胶质瘤细胞系对TMZ具有天然耐药性。因此,对于胶质瘤患者,尤其TMZ耐药类型的,迫切需要开发创新的治疗方法或发现有效的抗癌药物来改善胶质瘤的预后。随着提取纯化技术的发展,对恶性肿瘤细胞具有抑制作用的天然化合物受到广泛关注,被认为是有前途的抗癌治疗剂。然而,识别这些天然抗癌剂的分子靶标具有挑战性。网络药理学是药物发现的一种新方法,有望通过建立“化合物-蛋白质/基因-疾病”网络,加深我们对药物跨多层信息作用的理解,并能更有效地揭示小分子的调节原理。OSW-1是一种天然化合物,尚未在神经胶质瘤中进行研究,其潜在机制也未完全阐明。据我们所知,还没有基于OSW-1的网络药理学的结构-功能分析。目的:本研究的目的是探讨OSW-1抗胶质瘤的作用及其相关机制,以及研究OSW-1是否能增强胶质瘤耐药细胞的TMZ敏感性,并阐明可能的作用机制。方法:在本研究中,我们先采用网络药理学的方法,通过对OSW-1-靶点-胶质瘤网络、蛋白质-蛋白质互作（Protein-protein interaction,PPI）网络、基因本体论和通路富集的分析,预测OSW-1抗胶质瘤作用的潜在靶点和参与调控的信号通路。分子对接技术被用于验证OSW-1和核心靶点的结合能力。体外实验中,我们选取T98G和LN18胶质瘤细胞系作为研究对象。CCK-8和细胞克隆实验被用于检测OSW-1对细胞存活率和增殖能力的影响。通过流式细胞术检测OSW-1对细胞周期分布和死亡方式的影响。通过Western blotting检测OSW-1对细胞和组织相关蛋白表达的影响。慢病毒包装和细胞感染用于构建O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O6-methylguanine DNA methyltransferase,MGMT）过表达细胞系。DFCH-DA染色法用于检测细胞内活性氧（Relative oxygen species,ROS）的水平。体内实验中,我们构建了LN18胶质瘤细胞裸鼠移植瘤模型。通过Western blotting和免疫组化检测相关蛋白的表达情况来验证OSW-1对胶质瘤细胞的作用。HE染色被用于检测OSW-1对裸鼠主要脏器的影响。结果:1.从Pharm Mapper、Swiss Target Prediction和Ch EMBL数据库共获取到403个OSW-1作用靶标;从Therapeutic Target Database、OMIM和Gene Cards数据库中共获得出1296个胶质瘤相关基因。最后,构建了一个包含151个交叉基因的OSW-1-靶点-胶质瘤网络。2.通过对PPI网络分析,发现PI3KR1、SRC、MAPK1、AKT1、HRAS、HSP90AA1、GRB2、PEPN11、LCK和RHOA这些靶点与OSW-1发挥胶质瘤作用有关。分子对接证明OSW-1与这些靶点的结合能力。3.通过GO富集分析,提示OSW-1可能参与信号转导、凋亡、细胞增殖、蛋白质磷酸化、细胞迁移的调节;通过KEGG通路富集分析,提示OSW-1可能通过调控PI3K/AKT信号通路发挥抗胶质瘤作用。4.CCK-8和细胞克隆实验证实OSW-1可以抑制胶质瘤细胞的活力和增殖能力。流式细胞术证明OSW-1可以将胶质瘤细胞周期阻滞于G2/M期和诱导胶质瘤细胞发生凋亡。Western blotting证实OSW-1可以抑制胶质瘤细胞PI3K/AKT通路的激活。740Y-P,一种PI3K/AKT激动剂,可以对抗OSW-1介导的上述抗胶质瘤作用。5.OSW-1联合TMZ可以协同抑制胶质瘤细胞的增殖活力,且减少胶质瘤细胞MGMT和p-AKT1的表达水平。过表达MGMT和激活AKT1可以逆转OSW-1联合TMZ对胶质瘤细胞活力的抑制。6.抗氧化剂NAC可以逆转OSW-1诱导的ROS的过度产生,最终导致OSW-1引起的MGMT表达减少和AKT1的失活效应减弱。7.裸鼠皮下移植瘤模型显示,OSW-1显著抑制LN18胶质瘤细胞体内生长,Western blotting和免疫组化结果分别显示OSW-1在体内抑制PI3K/AKT通路的激活和MGMT的表达。裸鼠体内主要脏器的HE染色结果证明OSW-1对裸鼠脏器无明显损伤,证实OSW-1在体内的用药安全性。结论:1.通过网络药理学和分子对接技术分析,OSW-1可通过多靶点、多途径发挥抗胶质瘤作用。2.体内外实验证实,OSW-1可抑制胶质瘤细胞增殖。3.OSW-1通过抑制PI3K/AKT通路的激活,从而抑制胶质瘤细胞增殖活力、阻滞胶质瘤细胞周期进程和诱导胶质瘤细胞发生凋亡。4.OSW-1通过诱导ROS的过度生成,抑制胶质瘤细胞MGMT的表达和AKT1的激活,从而增加胶质瘤细胞TMZ敏感性。