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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是发病率仅次于阿尔采默病的神经系统变性病,其发病机制至今尚不明确。帕金森病以黑质细胞脱失,残存的黑质细胞胞浆内出现Lewy小体为特征性病理损害。Lewy小体形成可能与黑质细胞泛素—蛋白酶体(Ubiquitin-Proteasome System,UPS)功能减退,削弱了对α-synuclein等胞内蛋白的降解与清除有关。在帕金森病患者黑质发现有蛋白酶体功能减退;蛋白酶体相关酶类的基因突变可以引起家族性帕金森病。这些结果都提示蛋白酶体功能减退参与了帕金森病的发病。乳胞素(Lactacystin)是链酶菌素的代谢物,对蛋白酶体的20S颗粒有选择性、不可逆抑制作用。本课题组已建立Lactacystin所致的帕金森病偏侧大鼠模型。在此基础上,我们继续探讨如何减轻蛋白酶功能减退引起的多巴胺能神经元损伤。我们以Lactacystin干预PC12细胞和立体定向注射大鼠右侧内侧前脑束(Middle Forebrain Bundle,MFB)为模型,研究过表达胶质细胞源性营养因子(Glial-cell Derived Neurotrophic Factor,GDNF)的骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs)的保护作用。第一部分GDNF慢病毒表达载体的构建及病毒的生产目的建立GDNF慢病毒表达质粒,并在293FT细胞中合成和收获病毒,同时测定病毒滴度。材料与方法:以pCDNA-GDNF为模板,设计含酶切位点的上下游引物,将扩增的PCR产物和pLenti6/V5-LacZ进行BamH I,Xho I双酶切,将酶切产物以T4连接酶连接。转化后挑选正确的克隆酶切鉴定,经测序证实表达载体构建正确。以脂质体转染法将GDNF和包装质粒共同转染293FT(以LacZ表达质粒为阳性对照),72h后收获病毒离心过滤,最后超速离心将沉淀重悬得到病毒储存液。以BMSCs测定病毒滴度。结果:经酶切和测序鉴定,pLenti6╱V5-GDNF序列正确,与病毒标志肽段V5融合表达。经293FT细胞包装后收获了病毒储存液,病毒滴度分别为GDNF(5.6×105 TU/ml),LacZ(4.3×105 TU/ml)。结论:成功构建了GDNF慢病毒表达质粒,并生产了具有感染能力的病毒储存液。第二部分慢病毒介导GDNF在BMSCs中的表达及其对Lactacystin引起PC12细胞损伤的保护作用目的:将携带GDNF基因的慢病毒转导至BMSCs,检测其过表达水平,并探讨过表达GDNF能否保护蛋白酶抑制剂(Lactacystin)引起PC12细胞的损伤。材料与方法:携带GDNF的慢病毒以MOI=1感染BMSCs后,利用RT-PCR、ELISA和免疫细胞化学方法检测GDNF的表达水平。利用MTT法检测GDNF-BMSC细胞培养上清预处理PC12能否减轻Lactacystin引起的损伤。结果:GDNF-BMSCs经RT-PCR和免疫细胞化学证实有外源性GDNF表达,且感染率达95%以上。ELISA检测显示感染病毒后24h开始,上清中GDNF含量较BMSCs组显著增高(P值<0.001),72h达到800pg/ml。GDNF-BMSCs培养上清对Lactacystin(10μm)引起的PC12的损伤有保护作用(P值=0.0004)。结论:慢病毒介导的GDNF能高效感染骨髓基质细胞,分泌具有生物学活性的GDNF,减轻Lactacystin引起的PC12细胞损伤。第三部分GDNF-BMSCs基因工程细胞移植治疗Lactacystin所致偏侧PD大鼠模型的模型目的:探讨预移植GDNF-BMSCs基因工程细胞对Lactacystin所致偏侧PD大鼠模型的保护作用。材料与方法:取雌性SD大鼠64只,随机分为对照组、lactacystin组、LacZ-BMSCs移植组(LacZ组)和GDNF-BMSCs组(GDNF组)。LacZ组和GDNF组于右侧纹状体四点注射2×105个基因工程细胞,对照组和lactacystin组注射0.01M PBS(20μl),细胞移植1周后,在lactacystin组和LacZ组、GDNF组大鼠右侧MFB立体定向注射lactacystin 2μg,NS组注射等量的生理盐水。观察大鼠行为变化、黑质致密区(SNc)TH阳性细胞数、纹状体TH阳性纤维灰度、黑质TH免疫印迹、以及纹状体区多巴胺含量。结果:GDNF组和LacZ组大鼠阿朴吗啡诱导的旋转次数显著低于Lactacystin组(P<0.05)。GDNF组和LacZ组纹状体TH阳性纤维和SNc区TH阳性神经元显著高于Lactacystin组(P<0.05),GDNF组SNc区TH阳性神经元高于LacZ组(P值<0.05)。免疫印迹结果显示,lactacystin组右侧TH表达显著低于左侧,而GDNF组无显著变化(P=0.361),LacZ组有明显减低(P<0.05),但仍高于Lactacystin组(P=0.023)。GDNF组(25.53±16.18 pmol/mg总蛋白,P=0.0016)和LacZ组(20.71±17.78 pmol/mg总蛋白,P=0.025)右侧纹状体多巴胺含量显著高于Lactacystin组(1.01±1.29 pmol/mg总蛋白)。结论:GDNF-BMSCs和LacZ-BMSCs工程细胞移植能减轻Lactacystin引起的中脑黑质多巴胺能神经元的损伤,GDNF-BMSCs的保护作用优于LacZ-BMSCs。结论1.构建了GDNF慢病毒表达载体,经293FT细胞包装生产了具有感染能力的病毒颗粒。2.GDNF慢病毒感染骨髓基质细胞后过表达,分泌至上清中的GDNF达到800pg/ml。该上清能减轻蛋白酶抑制剂Lactacystin引起的PCI2细胞的损伤,具有神经保护作用。3.经MFB局部立体定向注射2μg Lactacystin,可以引起黑质多巴胺能神经元的损伤。4.LacZ-BMSCs和GDNF-BMSCs纹状体移植能减轻Lactacystin所致黑质多巴胺能神经元的损伤,GDNF-BMSCs疗效优于LacZ-BMSCs组。