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该试验应用自制的抗K<,99>和F<,41>菌毛单因子血清通过玻板凝集试验检测ETEC致病因子K<,99>和F<,41>菌毛抗原时发现,我们所购买的标准菌株C83919(O <,101>:K<,30>,F<,41>:H)、C83921(O <,101>:K<,27>,F<,41>:H)、C83287(O <,101>:F<,41>)、C83920(O <,101>:K<,30>:F<,41>)除与F<,41>单因子血清发生凝集外,还能与抗K<,99>单因子血清发生凝集.而C83286(K<,12><->:K<,99>)只与K<,99>单因子血清发生凝集,C83992 (O <,101>:K<,99>,F<,41>)、C83286( O <,38>:K<,99>,F<,41>)能与K<,99>和F<,41>两种单因子血清发生凝集.聚合酶链应(PCR)在病原菌及毒素的检测和鉴定方面具有简便、快速、特异性好、灵敏性高的优点.为一进一步检难和证实玻板凝集试验结果,设计了针对F<,41>、K<,99>毛基因及编码耐热肠毒素ST基因的特异性引物,经BLAST软件分析表明具有良好的特异性.尔后建立了F<,41>基因、K<,99>基因及ST基因多重PCR扩增方法,并对影响多重PCR扩增的条件及退火温度等进行优化,结果以dNTP终浓度为0.125mmol/L、Mg<2+>终浓度为1.25mmol/L、引物终浓度为1.25μmol/L、退火温度为54℃时,PCR扩增结果较为理想.然后利用优化后的条件和退火温度进行PCR灵敏性和特异性检测,结果多重PCR检测F<,41>、 K<,99>及ST的灵敏性可达到10<3>cfu?ml;应用F<,41> 和K<,99>阴性的大肠杆菌和其它菌株作为对照进行多重PCR扩增,结果均为阴性.用该多重PCR方法对试验菌株进行扩增,在只标有F<,41>菌毛的菌株均检测到了K<,99>基因的存在,而仅标有K<,99>的C83912菌体只检到了K<,99>基因.结果表明,多重PCR方法在检测和鉴定ETEC致病因子方面优于传统方法,具有简便、快速、特异、灵敏的优点;在标明F<,41><+>的某些标准菌株上还存在K<,99>基因;F<,41>、 K<,99>菌毛抗原为截然不同的两种蛋白质.