植酸酶作为畜禽及水产等动物的一种绿色饲料添加剂，已日益广泛使用于饲料工业中，其使用效果已在世界范围内得到了确证。根据其最适pH值，植酸酶主要分为酸性(EC3.1.3.8，phyA基因编码)及中性植酸酶(EC3.1.3.26，phyC基因编码)。其中来源于真菌的酸性植酸酶，其酶促反应的pH有效作用范围在2.5～5.5之间，目前，以对真菌来源的酸性植酸酶研究最多，并进行了规模化发酵生产。而中性植酸酶其酶促反应的pH有效作用范围在6～9之间，由于研究较少，产酶量较低等原因的尚无商品投入市场。而对于融合植酸酶的研究也未见报道。 为提高中性植酸酶的产量，本论文首次优化设计了中性植酸酶phy C基因，获得了优化设计的phyCs基因，并现实了其在毕赤巴斯德酵母的表达；为拓宽植酸酶的pH作用范围，降低生产成本，本研究创造性地将酸性植酸酶phy A及中性植酸酶phy Cs基因融合连接，并首次现实了融合基因phy A-phy Cs在毕赤巴斯德酵母的表达；完成了对重组酵母菌的液体发酵实验；并对重组植酸酶的酶学性质进行了研究。 本论文主要开展了以下研究： 1.从课题组成功克隆的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WHNB02中性植酸酶基因phyC(GenBank No：AF AY220075)出发，对phyC基因进行生物学分析。分析表明该基因全长1152bp，编码一个383个氨基酸的多肽，其中编码成熟肽基因序列长1074bp，编码358氨基酸成熟肽。其中(G+C)％含量为46.2％，密码子第三位(G+C)％碱基含量为56.7％；加上毕赤酵母α因子信号肽后(G+C)％为44.3％，密码子第三位(G+C)％碱基含量为43.6％。按P.pastoris密码子偏爱性，密码子分析显示基因中RSCU值<0.3的密码子数量为118个，占整个基因密码子的33％。对phyC基因mRNA分析表明，phyC基因mRNA折叠后最小自由能△G=-437.30 kcal/mol，其起始密码子被包裹在mRNA折叠所形成的发夹环中。 2.确定优化方案设计phyC基因，并首次人工合成phyC基因。全方位改造天然phyC基因序列，根据毕赤酵母密码子偏爱性，去除植酸酶基因中酵母表达低频密码子，替换为酵母高频密码子，获得能在毕赤酵母中高效表达的中性植酸酶优化基因长度为1074bp的phyCs，改造后的基因与phyC基因的同源率为73.5％，(G+C)％变为49.1％，密码子第三位GC碱基含量变为60.1％；加上毕赤酵母α因子信号肽后(G+C)％变为46.2％，密码子第三位GC碱基含量变为52％；消除了序列中的AT富含区；自由能AG由提高至-434.90kcal/mol，其起始密码子并为被包裹在mRNA折叠所形成的发夹环中；在合成基因上游5’端加入SnaBI酶切位点，下游3’端加入NotI酶切位点，以便基因转入表达载体pPIC9K。 3.经克隆及序列测定后，首次构建了优化中性植酸酶基因酵母表达载体pPIC9K-phyCs。经SacI线性化后，电转化毕赤巴斯德酵母宿主菌GS115，经MD和MM平板筛选、PCR检测和酶活性测定，获得阳性重组酵母，实现了phyCs基因在酵母中的分泌表达。结果表明，经甲醇诱导摇瓶发酵120h后，优化phyCs基因重组酵母酶活达到18.5u/ml(wEBI)为优化前酶活的9倍，经液体分批补料发酵96h后，中性植酸酶酶活达到54U/ml(WBSG)，由此可见，中性植酸酶产量得到大幅度提高，SDS-PAGE分析显示，诱导植酸酶的分子量为51kDa，去糖基化后植酸酶大小为42kDa。 4.为拓宽植酸酶的pH作用范围，生产出满足单胃动物及水产动物的新型植酸酶，降低生产成本，构建了植酸酶融合phyA-phyCs基因表达载体pPIC9K-ACs。从酸性植酸酶基因phyA(GenBank No：AF218813)出发，根据phyA(经81位、82位Arg密码子进行同义突变)、phyCs基因序列及毕赤巴斯德酵母表达载体pPIC9K多克隆位点序列特点，采用PCR法获得植酸酶phyAm基因表达片段(上游插入SnaBI酶切位点，下游插入AvrⅡ酶切位点)，将扩增片段连入pUCm-T获得克隆载体pUCm-phyA；采用PCR法获得植酸酶phyCs基因表达片段并加入接头(G<,4>S)<,3>(上游插入AvrⅡ酶切位点，下游插入NotI酶切位点)，将扩增片段连入pUCm-T获得克隆载体pUCm-phyCs。AvrⅡ，NotI双酶切克隆载体pUCm-phyCs及表达载体pPIC9K，成功构建了融合植酸酶基因中间表达载体pPIC9K-phyCs。经酶切及序列测定后，SnaBI，AvrⅡ双酶切pPIC9K-phyCs及pUCm-phyA，本研究创造性地酸性植酸酶phyA及中性植酸酶phyCs基因融合连接，并构建了表达载体pPIC9K-phyACs。 5.BspEI线性化表达载体pPIC9K-phyACs后，电转化毕赤巴斯德酵母宿主菌GS115，首次实现了融合基因phyA-phyCs在毕赤巴斯德酵母的表达。经MD和MM平板筛选、PCR检测和酶活性测定，获得阳性重组酵母，首次实现了phyA-phyCs融合植酸酶基因在毕赤巴斯德酵母中分泌表达。研究结果表明，经甲醇诱导摇瓶发酵120h后，酶活达到20.5U/ml(WEBI)。发酵结果显示，发酵84h后融合植酸酶的酶活达到176U/ml。SDS-PAGE分析表明，诱导融合植酸酶糖基化较严重，去糖基化后植酸酶大小为94.6kDa，而酸性植酸酶去糖基化后大小为52.6kDa，由此可见融合植酸酶于酵母中表达成功。 6.对表达中性植酸酶、融合植酸酶的酶学性质进行了研究。经过硫酸铵沉淀、乙醇丙酮沉淀、透析、浓缩及层析离子交换纯化后，测定了重组中性及融合植酸酶的热稳定性值、最适反应pH值及最适反应温度等酶学性质。 结果显示重组中性植酸酶最适反应温度为70℃，最适pH值为7.5，pH6-9时植酸酶保持了较高的酶活性，80℃处理5分钟及10分钟残留酶活分别保持在97％及83％左右。与未优化前相比，pH作用范围从6-8扩大为6-9，最适反应温度提高了5℃，热稳定性相差不大。去糖基化后测定酶学性质显示植酸酶最适反应温度、最适pH值没有发生变化，但热稳定性下降，80℃处理5分钟及lO分钟残留酶活分别保持在77％及70％左右，比去糖基化前下降20％及13％。由此可见，优化重组植酸酶与未优化前植酸酶酶学性质相比，最适反应温度提高，pH值作用范围增大，糖基化对中性植酸酶的热稳定性有较大影响。 融合植酸酶纯化后，结果显示重组融合植酸酶最适反应温度为55℃，最适pH值出现三个峰值分别为2.5，5.5-6.0及7.0，pH5.5时酶活最高，pH7.0时候酶活为5.5的84％，pH2.5时酶活为5.5的82％。80℃处理5分钟及10分钟残留酶活分别保持在63％左右，85℃、90℃、95℃及100℃处理5分钟及10分钟残留均保留在50％-60％左右。由此可见，融合植酸酶pH作用范围变宽，其在pH2.5-7范围内均能保持较高酶活，与酸性植酸酶相比融合植酸酶的热稳定性也有一定的提高。 本文首次实现了优化设计并人工合成的中性植酸酶基因phyCs在毕赤巴斯德酵母中的表达，与未优化相比酶活提高了9倍；创造性地现实了融合植酸酶基因phyA-phyCs在毕赤巴斯德酵母的表达，表达的融合植酸酶具有较宽的pH作用范围，其在pH2.5-7范围内均能保持较高酶活，且具有较好的热稳定性；首次完成了对重组中性、酸性植酸酶酵母菌的液体发酵实验，中性植酸酶及融合植酸酶液体分批补料发酵后，酶活分别达到58U/ml和176ml。