目的：　　 子宫内膜异位症(内异症,Endometriosis,EMs)是育龄期妇女的常见病与多发病,具有浸润、转移及侵袭等恶性肿瘤的特征。迄今为止其发病机制仍未阐明。关于其发病机制,经血逆流学说是目前最被广为接受的理论。但该理论不能解释经血逆流的发生率有80%-90%,而内异症的发生率只有10%-15%。大量研究结果显示,内异症患者在位内膜与j下常子宫内膜在增殖、侵袭及凋亡等生物学特性方面存在差异。内异症在位内膜基因表达的异常改变可能是内异症在位内膜生物学特性发生改变的基础,这些改变可能直接影响子宫内膜异位症的发病过程。内异症在位内膜候选基因的基础研究,其重要临床意义不仅在于能进一步阐述内异症发生机理,还能为临床诊断途径的突破、靶基因干预治疗的实现奠定理论基础。　　 cDNA代表性差异分析法(cDNArepresentationaldifferenceanalysis,eDNA-RDA)是Hubank等在RDA和mRNA差异显示两种方法基础上创立的一种基因克隆方法,己广泛应用于差异基因表达谱的筛查和新基因的克隆。本课题组旨在通过cDNA代表性差异分析技术筛查内异症在位内膜上调表达基因,寻找与内异症发生发展密切相关的候选基因。选取筛查获得的内异症在位内膜上调表达基因之一,应用Real-timePCR技术扩大样本进一步检测该基因在内异症在位内膜及对照组子宫内膜中的表达,初步验证筛查结果可靠性的同时,探讨该基因在子宫内膜异位症发病机制中的作用。　　 甲硫氨酸腺苷转移酶2A(methionineadenosyl-transferase,MAT2A)是前期通过cDNA代表性差异分析技术筛查获得的克隆重复次数最高的候选基因。目前,MAT2A基因与内异症相关研究尚未见报道。MAT是生物体内合成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)的关键酶,而SAM是甲基供体和多胺合成的前体,在所有细胞的体内代谢中发挥核心作用。哺乳动物组织中,存在两种不同的基因MAT1A和MAT2A,分别编码两个同源性MAT催化亚单位α1(形成二聚体的MATⅢ或四聚体的MATⅠ)和α2(形成MATⅡ)。另外还存在MAT2B,编码调节亚单位β,主要功能是抑制MATⅡ的活性。MAT1A仅在成人肝组织中表达,MAT2A在所有非肝组织中均表达。研究表明,MAT2A不仅是有丝分裂原活性细胞因子如肝细胞生长因子、瘦素等诱导细胞增殖的重要靶点,而且能通过诱导FasL表达,最终上调细胞内Caspase-3水平,促进细胞凋亡。MAT2A基因表达上调促进细胞增殖、抑制细胞凋亡,目前报道表明与肝癌、结肠癌、膀胱癌、前列腺癌等许多疾病的发生发展密切相关。内异症虽为良性疾病,却具有增殖、侵袭、复发和转移等类似恶性肿瘤的生物学特性。那么与细胞增殖、凋亡等生物学特性密切相关的MAT2A基因是否也参与内异症的发病机制呢?MAT2A在内异症的发生发展过程中扮演着什么角色?本研究在国内外首次探讨MAT2A在内异症发病机制中的作用。　　 方法：　　 一、应用cDNA代表性差异分析技术筛查子宫内膜异位症在位内膜上调表达基因　　 (一)提取内异症在位内膜及对照组子宫内膜组织样本总RNA,分光光度计检测总RNA纯度及浓度,琼脂糖电泳验证RNA完整性。　　 (二)DNA酶去除总RAN中残留的基因组DNA,消除基因组的污染。　　 (三)分离内异症在位内膜及对照组子宫内膜组织总RAN中的mRNA,去除rRNA的污染,分光光度计检测mRNA纯度及浓度,琼脂糖电泳验证mRNA提取质量。　　 (四)分别以内异症在位内膜组织mRNA及对照组子宫内膜组织mRNA作为模板合成双链cDNA。　　 (五)内异症患者在位内膜作为实验组(Tester组),无内异症患者子宫内膜作为对照组(Driver组),逐级提高Driver组比例进行2轮消减杂交,获得内异症在位内膜中表达上调的差异基因片段。　　 (六)克隆差异基因片段、菌粒PCR鉴定、测序并同源性分析。　　 (七)选取筛查获得的COX-2基因,Real-timePCR检测内异症在位内膜及对照组子宫内膜组织中COX-2mRNA的表达,初步验证筛查结果的可靠性。同时选取克隆重复次数最高,目前报道生物学特性与子宫内膜异位症发病密切相关的MAT2A基因进行后续深入研究。　　 二、MAT2A基因在子宫内膜异位症发病机制中的作用研究　　 (一)RealTimePCR、Westernblot及免疫组化技术分别检测内异症在位内膜与对照组子宫内膜组织中MAT2AmRNA及蛋白表达。　　 (二)原代培养内异症在位内膜间质细胞(ESC)及对照组子宫内膜间质细胞(NSC),免疫细胞化学染色鉴定细胞。同时构建3个MAT2AshRNA表达载体pGC-MAT2A-s1、pGC-MAT2A-s2和pGC-MAT2A-s3转染ESC;构建pEGFP-C1-MAT2A重组质粒转染NSC。　　 (三)RealTimePCR及Westernblot技术分别检测ESC中MAT2A基因RNA干扰效果及NSC在转染pEGFP-C1-MAT2A重组质粒后MAT2A表达水平。　　 (四)CCK-8细胞增殖实验检测MAT2A表达改变前后细胞增殖能力的变化。　　 (五)Transwell细胞侵袭实验检测MAT2A表达改变前后细胞侵袭能力的改变。　　 (六)酶联免疫吸附试验检测MAT2A表达改变前后细胞内SAM、Caspase-3水平变化。　　 (七)透射电镜(TEM)观察MAT2A表达改变前后细胞超微结构的改变。　　 结果：　　 一、cDNA代表性差异分析法筛查获得内异症在位内膜上调表达基因10个　　 随着消减杂交轮数的增加,所获得的差异片段数目减少,特异性扩增信号不断增强,第二轮杂交后,1.5%琼脂糖电泳可见条带集中分布于100-500bp之间。克隆差异片段送测序,177个EST序列测序成功,GenBank中进行同源性比对,其中有8个(4.52%)EST序列在数据库中未找到匹配基因和蛋白,余169个EST序列比对筛查获得Ems在位内膜上调表达基因lO个。其中已报道与Ems相关基因4个:COX-2、CFLI、BRAF、NRAS;EMs以外疾病相关基因4个:MAT2A、SEPT9、ATAD3A、CADM2;目前所有疾病中未见报道,功能未知基因2个:NAA15、CCDC21。选取COX-2基因,应用RealTimePCR技术验证筛查结果表明,EMs在位内膜组COX-2mRNA水平显著高于对照子宫内膜组,与筛查结果一致。　　 二、MAT2A基因在子宫内膜异位症发病机制中的作用研究　　 (一)内异症在位内膜和对照组子宫内膜组织中MAT2A基因表达　　 1.RealTimePCR结果表明,内异症在位内膜组MAT2AmRNA相对表达水平为3.20±2.05,显著高于对照组子宫内膜1.23±0.97。　　 2.Westernblot结果表明,内异症在位内膜MAT2A蛋白表达(0.63±0.43)高于对照组子宫内膜(0.20±0.08)。　　 3.免疫组化结果表明,MAT2A在子宫内膜组织的腺体和间质细胞均表达,内异症在位内膜MAT2A蛋白表达(MOD:0.26±0.13)高于对照组子宫内膜(MOD:0.19±0.12)。　　 (二)MAT2A对子宫内膜异位症在位内膜及对照组子宫内膜间质细胞生物学活性的影响　　 1.RealTimePCR结果及Westernblot结果表明,ESC组MAT2AmRNA及蛋白表达水平显著高于NSC组。pRC-MAT2A-s1、pRC-MAT2A-s2和pRC-MAT2A-s3组MAT2AmRNA及蛋白表达水平分别与ESC组比较明显降低,其中pRT-MAT2A-s3组MAT2AmRNA及蛋白表达水平最低。ESC转染pRC-V质粒组MAT2AmRNA及蛋白表达水平与ESC组比较差异无统计学意义。NSC转染pEGFP-C1-MAT2A质粒组MAT2AmRNA及蛋白表达水平显著高于NSC组。NSC转染pEGFP-C1-V质粒组MAT2AmRNA及蛋白表达水平与NSC组比较差异无统计学意义。　　 2.CCK-8细胞增殖实验表明,从转染pGC-MAT2A-s3表达载体48h开始,ESC增殖率明显受到抑制,转染pRC-V对照质粒后ESC增殖率无明显变化;而NSC在转染pEGFP-C1-MAT2A质粒48h开始,增殖率显著上调;转染pEGFP-C1-V质粒后NSC增殖率无明显变化。　　 3.细胞侵袭实验结果显示,ESC侵袭力显著高于NSC:转染pGC-MAT2A-s3表达载体后ESC侵袭力显著下降,转染pRC.V对照质粒的ESC侵袭力无显著变化;NSC在转染pEGFP-C1-MAT2A质粒后侵袭力显著提高,转染pEGFP-C1-V质粒后NSC侵袭力无明显变化。　　 4.酶联免疫吸附试验结果表明,ESC组细胞内SAM水平高于NSC组,Caspase-3水平低于NSC组。ESC沉默MAT2A组(pRC-MAT2A-s3)与ESC组比较,细胞内SAM水平降低,Caspase-3水平升高。ESC转染空质粒组与ESC组比较细胞内SAM、Caspase-3水平没有改变,P＞0.05。NSC转染pEGFP-C1-MAT2A质粒组与NSC组比较,细胞内SAM水平升高,Caspase-3水平降低。NSC转染空质粒组与NSC组比较细胞内SAM、Caspase-3水平没有改变。　　 5.透射电镜实验表明,虽然ESC组细胞核型较规则,ESC转染空质粒组部分细胞核形状不规则,两组细胞均没有明显观察到染色质凝聚边集。沉默MAT2A表达后,ESC细胞内明显可见异染色质凝聚边集,呈现凋亡特征。NSC及NSC转染空质粒组细胞核不规则,可观察到部分染色质边集发生,呈现早中期凋亡特征;上调MAT2A表达后,NSC细胞核型较规则,异染色质边集少见,凋亡能力降低。　　 结论：　　 1.利用cDNA代表性差异分析技术成功鉴定内异症在位内膜上调表达基因,这些基因或参与新生血管形成,或与细胞信号转导有关,或与细胞增殖、凋亡密切相关,或与细胞粘附、侵袭相关,可能通过影响子宫内膜的生物学特性,在子宫内膜异位症的发生发展中发挥着重要的作用。COX-2是筛查获得的内异症在位内膜上调表达基因之一,本研究通过RealTimePCR实验进一步验证表明,内异症组在位内膜COX-2mRNA表达显著高于对照组子宫内膜。COX-2基因异常表达可能在内异症的病理生理过程中发挥重要作用。　　 2.MAT2A基因是筛查获得的克隆重复次数最高的内异症在位内膜上调表达基因,进一步扩大样本验证表明MAT2A在内异症在位内膜组织中的表达显著高于对照组内膜组织。体外实验研究表明,MAT2A基因在内异症在位内膜间质细胞中表达上调,促进子宫内膜细胞增殖、侵袭,抑制子宫内膜细胞凋亡,MAT2A基因表达上调可能通过改变子宫内膜细胞的生物学特性参与子宫内膜异位症的发生发展。