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目的本课题临床研究选取与线粒体功能障碍相关的重症肌无力(myasthenia gravis,MG)脾气虚证患者为研究对象,通过观察MG患者外周血线粒体OGG1、NTH1、MPG的mRNA表达及mtDNA缺失的变化,以能量代谢为切入点探讨脾气虚证发病机制;动物实验研究通过观察脾虚证模型大鼠骨骼肌线粒体SOD、GSH-Px活性及MDA含量变化以及健脾益气中药对其影响,从自由基角度探讨脾虚证能量代谢障碍机制,为进一步阐明健脾益气方药的作用机制提供客观的科学依据。方法临床研究病例标本来源于2012年04月至2013年07月于广州中医药大学第一附属医院脾胃病科住院的病例,共收集脾气虚证MG Ⅱb型患者16人,并在本校师生志愿者中招募健康志愿受试者8人。专人询问各受试对象的一般资料,并抽取各受试对象的清晨空腹外周静脉血3.5ml,采用聚合酶链反应PCR(polymerase chain reaction,PCR)方法检测线粒体OGG1、NTH1、MPG的mRNA表达及mtDNA缺失的改变。动物实验研究选用42只SPF级SD大鼠,随机分为两组,即正常组10只,模型组32只,模型组大鼠皮下注射利血平注射液0.5mg/kg/d,正常组大鼠皮下注射等量的生理盐水,每日1次,共8d,记录大鼠一般状况、测定尿D-木糖排泄率以判断脾虚证模型是否成功建立。模型组大鼠出现摄食量减少、明显消瘦、大便稀溏及尿D-木糖排泄率下降等改变,证实造模成功。采用随机数字表法随机抽取7只正常组大鼠及14只模型组大鼠,将模型组大鼠分为四君子汤组和脾虚组,每组各7只,给药组灌胃四君子汤1Og/1Oml/kg,脾虚组和正常组灌胃等量的生理盐水,每日1次,持续3w,记录大鼠一般状况。给药3w结束后,检测尿D-木糖排泄率,提取骨骼肌线粒体,检测线粒体SOD、GSH-Px活性及MDA含量变化,观察四君子汤对上述指标的影响。结果1.脾气虚组MG患者外周血mtDNA存在不同程度的片段缺失,脾气虚组MG患者外周血缺失型mtDNA/野生型mtDNA比值较正常对照组显著增高(P<0.01)。2.脾气虚组MG患者线粒体OGG1、NTH1、MPG的mRNA表达高于正常对照组,其中脾气虚组MG患者线粒体OGG1的mRNA表达高于正常对照组(P<0.05),脾气虚组MG患者线粒体NTH1、MPG的mRNA表达明显升高,显著高于正常对照组(P<0.01)。3.造模开始后,模型组大鼠体重显著降低(P<0.01)。停止造模后,脾虚组和四君子汤组大鼠一般状况逐渐好转、体重上升,四君子汤组大鼠体重仍显著小于正常组(p<0.01),四君子汤组大鼠体重较脾虚组有上升趋势,两组相比无统计学意义(P>0.05)。给药3周结束后,四君子汤组尿D-木糖排泄率基本恢复(P>0.05),脾虚组与正常组尿D-木糖排泄率仍具有显著性差异(P<0.01)。4.与正常组相比,脾虚组大鼠骨骼肌线粒体SOD、GSH-Px活性降低(P<0.05),MDA含量上升(P<0.05);与脾虚组相比,四君子汤组大鼠骨骼肌线粒体SOD、GSH-Px活性升高及MDA含量降低,具有统计学意义(P<0.05)。结论1.脾气虚证MG患者存在mmtDNA缺失,导致呼吸链氧化磷酸化功能异常,最终引起细胞能量代谢障碍;脾气虚证MG患者外周血线粒体OGG1、NTH1、MPG的mRNA表达均很高,机制可能为脾气虚证存在线粒体损伤,引起线粒体DNA的自我修复,故三个糖基化酶均高表达。2.采用利血平造模法复制脾虚证大鼠模型,通过观察大鼠一般状况、尿D-木糖排泄率,结果显示符合脾虚证动物模型要求。脾虚证模型大鼠骨骼肌线粒体SOD、GSH-Px活性降低,MDA含量升高,表明脾虚证模型大鼠体内存在脂质过氧化损伤,提示脾虚证与线粒体氧化损伤密切相关;采用四君子汤对脾虚证模型大鼠进行干预治疗后,发现四君子汤能提高骨骼肌线粒体SOD、GSH-Px活性,降低MDA含量,提示健脾益气中药可以提高机体抗氧化能力,减少脂质过氧化产物,进而减轻线粒体氧化损伤,调节机体能量代谢。