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1 GCN5与压力负荷性心肌肥厚的相关性研究目的:压力负荷性心肌肥厚在临床上是一种十分常见的疾病,其终末期可进展为严重的心力衰竭。但根据压力负荷性心肌肥厚的相关研究结果表明,目前其发病机制尚不明确,且临床上尚无理想的治疗药物。一般控制非抑制蛋白5（general control nonrepressed protein 5,GCN5）作为一种组蛋白赖氨酸乙酰基转移酶参与了多种生理及病理过程,然而GCN5在压力负荷性心肌肥厚发生发展过程中所起到的作用目前尚有待研究。本部分旨在明确GCN5在压力负荷性心肌肥厚模型中的表达情况。方法:（1）动物学水平,通过对小鼠进行主动脉弓缩窄手术（transverse aortic constriction,TAC）来构建压力负荷性心肌肥厚的病理模型,在建模后不同时间点（2周和4周）利用小动物超声检测心功能,HE、MASSON、WGA等组织学染色分别检测心肌细胞横截面积的大小以及心肌纤维化程度,通过Western Blot和RT-PCR分别于蛋白及m RNA水平检测心衰相关指标（ANP、β-MHC）的表达变化情况。（2）细胞学水平,用苯肾上腺素（phenylephrine,PE）刺激SD大鼠新生乳鼠心肌原代细胞（neonatal rats cardiomyocytes,NRCMs）来构建压力负荷性心肌肥厚细胞学模型,对心肌细胞骨架蛋白α-actinin染色显示心肌细胞表面积,Western Blot和RT-PCR检测心衰相关指标（ANP、β-MHC）。（3）通过RT-PCR和Western Blot分别检测TAC术后心脏组织中和PE刺激后心肌细胞中的GCN5在m RNA及蛋白水平的表达变化情况。结果:（1）动物学水平,与假手术组（SHAM组）相比,TAC模型建立2周和4周后小鼠心功能呈时间依赖性减弱。HE、WGA染色显示随模型建立时间延长心肌细胞表面积逐渐增大,MASSON染色显示心脏中管周及间质纤维化程度逐渐增强。RT-PCR和Western Blot的实验结果发现TAC术后心脏组织中GCN5在m RNA与蛋白水平上的表达明显增加。（2）细胞学实验发现,与对照组相比,PE刺激NRCMs 24h后心肌细胞表面积明显增大。PE刺激后心肌细胞中GCN5在m RNA与蛋白水平上的表达明显升高。结论:小鼠经TAC手术干预及NRCMs在PE刺激后可分别于体内及体外成功建立压力负荷性心肌肥厚模型。GCN5在压力负荷性心肌肥厚模型中表达增加。2 GCN5在压力负荷性心肌肥厚中的作用研究目的:通过第一部分实验,我们发现GCN5在压力负荷性心肌肥厚模型中表达增加,本部分将继续探究GCN5在压力负荷性心肌肥厚发生发展过程中所发挥的作用。方法:（1）动物学水平,选用9型腺相关病毒为载体构建GCN5过表达的AAV病毒（Adeno-associated virus-GCN5,AAV-GCN5）,向C57BL/6J小鼠进行尾静脉注射该病毒以实现GCN5在小鼠心脏组织的过表达;应用GCN5特异性抑制剂丁内酯（Butyrolactone 3,MB3）对C57BL/6J小鼠进行腹腔注射以抑制GCN5的活性。上述小鼠分别构建TAC模型,TAC手术4周后,对过表达GCN5组、GCN5抑制剂组小鼠、及相应的对照组小鼠进行相关指标检测。首先检测实验终点小鼠的体重（body weight,BW）、心重（heart weight,HW）、肺重（lung weight,LW）;小动物超声评价小鼠心功能;HE、WGA、MASSON染色分别检测各组小鼠心脏心肌细胞的大小以及心脏管周及间质纤维化的情况;RT-PCR检测心衰指标（ANP、BNP、β-MHC、α-MHC）和心肌纤维化指标（Collagen-1、Collagen-3、TGF-β）;另外,应用Western Blot实验方法检测凋亡相关指标（Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase3、Caspase3）表达情况。（2）细胞学水平,构建GCN5过表达腺病毒（Adenovirus-GCN5,Ad-GCN5）及GCN5低表达腺病毒（Adenovirus-sh GCN5,Ad-sh GCN5）,通过NRCMs感染Ad-GCN5及Adsh GCN5的方法实现对GCN5的过表达及敲低后给予PE刺激24h,利用α-actinin的免疫荧光染色直观地反映心肌细胞的表面积大小,RT-PCR检测心衰相关指标（ANP、BNP、β-MHC、α-MHC）,Western Blot检测心衰（ANP、β-MHC）及凋亡相关指标（Bax、Bcl2、Cleaved-caspase3、Caspase3）,TUNEL染色评价GCN5对心肌细胞凋亡的影响情况。结果:（1）动物学实验发现,与AAV-Vector组相比,AAV-GCN5组小鼠在TAC术后4周的心脏收缩功能降低更加显著,HW/BW、LW/BW明显升高。组织学染色显示AAVGCN5组小鼠在TAC术后4周心肌细胞横截面积更大,心肌纤维化程度更加严重。此外,与对照组相比,MB3组小鼠TAC术后4周心脏收缩功能有所改善,心肌肥大及心肌纤维化程度明显减轻。（2）细胞学实验发现,在PE刺激的条件下,过表达GCN5能够促进心肌细胞肥大及心肌细胞凋亡。敲低GCN5能够减轻PE刺激后心肌细胞肥大及心肌细胞凋亡。结论:（1）过表达GCN5能够加重压力负荷性心肌肥厚的严重程度;（2）敲低或抑制GCN5能够减轻压力负荷性心肌肥厚的严重程度。3 GCN5在压力负荷性心肌肥厚中的机制研究目的:在明确GCN5对于压力负荷性心肌肥厚发生发展过程中的作用后,进一步阐明GCN5在压力负荷性心肌肥厚中发挥作用的分子机制。方法:（1）通过Western Blot方法检测动物水平过表达GCN5及应用GCN5特异性抑制MB3干预TAC模型小鼠4周后心脏组织中丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路中相关指标的磷酸化水平的变化（p-JNK、JNK、pERK、ERK、p-p38、p38）以及转化生长因子β活化激酶1（transforming growth factorβactive kinase 1,TAK1）的磷酸化水平表达;Western Blot方法检测PE刺激过表达及敲低GCN5后NRCMs中MAPK信号通路及TAK1的磷酸化水平。（2）为确定GCN5与TAK1之间的上下游关系以及确定TAK1在GCN5对心肌肥厚影响中的关键作用,免疫共沉淀实验（co-immunoprecipitation,Co-IP）检测TAK1在GCN5之间有无结合。在动物实验及细胞实验中给予TAK1抑制剂（inhibitor TAK1,i TAK1）干预,进一步验证TAK1信号通路在过表达GCN5对心肌肥厚影响中的作用。（3）在疾病模型中检测抑制GCN5活性后对GCN5表达的影响以及对TAK1及GCN5之间结合的影响,进一步检测抑制GCN5活性后对TAK1乙酰化水平的影响。（4）查阅大量资料找到可能影响TAK1磷酸化激活水平的分子TAK1结合蛋白1（TAK1-binding protein 1,TAB1）、TAK1结合蛋白2（TAK1-binding protein 2,TAB2）,Co-IP验证GCN5特异性抑制剂MB3对TAK1与TAB1及TAB2间结合水平的影响。结果:（1）过表达GCN5的小鼠在TAC手术4周后,对心脏组织蛋白进行检测发现,与AAV-Vector+SHAM组相比,过表达GCN5对MAPK信号通路的磷酸化激活水平无明显影响,但在TAC手术4周后的小鼠中发现,与AAV-Vector+TAC组相比,AAVGCN5+TAC组小鼠心脏组织中p-TAK1、p-JNK、p-p38的水平明显升高,但p-ERK的变化不明显。在给予MB3抑制剂的小鼠中发现,MB3干预对于SHAM组小鼠心脏组织中MAPK信号通路的磷酸化激活水平无明显影响,MB3+TAC组p-TAK1、p-JNK、p-p38水平较DMSO+TAC组明显降低,p-ERK的变化不明显。细胞学实验结果与动物学实验结果一致。（2）在动物实验水平,小鼠体内过表达GCN5并给予i TAK1干预后,小鼠心功能及HE、MASSON、WGA染色显示,过表达GCN5对于病理性心肌肥厚加重的作用消失,即AAV-GCN5+i TAK1组与AAV-Vector+i TAK1组小鼠在心功能及心脏病理程度一致。细胞学实验结果与动物学结果一致。（3）Co-IP实验证实心肌细胞中GCN5与TAK1存在相互结合,但在病理条件下抑制GCN5并不影响心肌细胞中GCN5与TAK1间的结合,也不影响TAK1的乙酰化水平。（4）PE刺激的条件下,心肌细胞中TAK1与TAB1和TAB2均存在结合,MB3干预能够减少TAB1与TAK1之间的结合,但MB3并不影响TAB2与TAK1间的结合。结论:GCN5通过激活TAK1-JNK/p38信号通路加重压力负荷性心肌肥厚的严重程度。