论文部分内容阅读
目的:脑恶性胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,约占成人颅内肿瘤的35%~60%,所有胶质瘤的60%。尽管当前的治疗方式多样,包括显微手术、放疗和化疗均有改进,但恶性胶质瘤病人的中位生存时间仍只有12个月。因此,提高5年生存率,探索治疗恶性胶质瘤的新方法,寻找新一代更有效、低毒和价廉的抗肿瘤药物,一直是亟待解决的课题。二烯丙基二硫(diallyl disulfide, DADS)是大蒜中的一种脂溶性的有效成分,对多种肿瘤均有明显的抑制作用,是一种很有开发潜力的抗肿瘤候选药物。维甲酸相关孤核受体α(RORα)可能参与肿瘤的调控。本实验室前期研究发现,RORα参与DADS抑制胃癌细胞的作用,因此推测RORα可能也参与DADS对恶性胶质瘤细胞的作用。本课题研究DADS对胶质瘤U251细胞增殖的作用,并观察其对RORα蛋白表达的影响,观察RORαmiRNA干扰对DADS处理前后U251细胞增殖的影响。探讨RORα在DADS抑制人胶质瘤细胞U251增殖中的作用,寻找DADS抑制人胶质瘤的新靶点。方法:1.采用MTT比色实验、群体倍增时间分析、形态学观察分析DADS对体外培养的人胶质瘤U251细胞的生长抑制效应;2.通过免疫细胞化学和Western blot技术分析RORα蛋白在DADS处理U251细胞前后的表达改变;3.根据GenBank提供的RORα基因序列设计4条RNA干扰序列,命名为miRNA1、miRNA2、miRNA3、miRNA4,并设计1条非特异性序列作为阴性对照。合成各自的寡核苷酸链,退火后与miRNA表达载体pcDNATM6.2- GW/EmGFPmiR连接,转化扩增后测序,将含靶向RORα的microRNA(miRNA)的质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFpmiR-RORα转染U251细胞,通过Western blot验证miRNA-RORα对RORα表达的抑制作用;4. MTT法检测和群体倍增时间分析RORα表达下调对DADS抑制胶质瘤细胞增殖的影响。结果:1.MTT比色实验结果显示,DADS对U251细胞具有明显的生长抑制效应且呈剂量-效应依赖关系。DADS浓度从15、22.5、30、37.5到45mg·L-1处理人胶质瘤U251细胞,其吸光值比对照组低,而且随浓度增加逐渐降低(P<0.05);相反,随着浓度增加,DADS对癌细胞增殖的抑制率从32.88%、41.83%、49.5%、59.42%到68.53%逐渐增强(P<0.05)。2.U251细胞群体倍增时间为21.86h,而DADS处理后的细胞,细胞群体倍增时间延长至36.69h,说明DADS有抑制细胞增殖作用(P<0.05)。3.倒置显微镜观察发现,DADS处理人胶质瘤U251细胞24h后,部分细胞浮起、变圆,体积缩小,贴壁细胞形态大小较一致,异型性减小,细胞间隙增大。4.免疫细胞化学结果显示,DADS处理U251细胞24h后,RORα蛋白在细胞核呈强阳性表达,与对照组的弱阳性表达相比,明显上调(P<0.05)。5.Western blot分析灰度扫描显示,DADS处理人胶质瘤U251细胞24、48h后,RORα蛋白表达分别为0. 69±0.13、1.37±0.25,较未处理组的0.22±0.16明显上调(P<0.05),且48h高于24h处理组(P<0.05)。6.重组pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-RORα-miRNA质粒经限制性酶切及DNA测序分析证明序列插入正确,荧光显微镜下观察细胞转染效率,可清晰地看到细胞内的绿色荧光。Western blot结果显示,转染RORα-miRNA1-4组细胞的RORα蛋白表达(0.38±0.06)(、0.35±0.09)、(0.3±0.12)(、0.1±0.007)明显低于转染negative-miRNA组(0.9±0.15)和未转染组(0.95±0.21)(P<0.05)。7.MTT结果显示,RORα干扰24h组(0.77±0.1333)细胞增殖率(光吸收值)高于未转染组(0.38±0.515)和转染阴性组(0.39±0.0465)(P<0.05)。并且,干扰RORα表达可削弱DADS对U251细胞的增殖抑制作用,干扰RORα24h后加DADS的细胞增殖率(光吸收值)(0.58±0.0864)明显高于DADS处理的未转染组(0.21±0.0631)和转染阴性组(0.2±0.0702)(P<0.05)。干扰48h组也与干扰24h组一样的变化。8. DADS处理后的各组细胞,细胞群体倍增时间都增长,其中转染RORα-miR3组由处理前的15.50 h延长至处理后的17.27 h;但DADS对转染后的细胞增殖抑制作用弱于DADS处理未转染组(由21.86h延长至36.69h)与空载体转染组(由22.01h延长至36.03h)的抑制作用。这说明RORα基因沉默削弱了DADS的抑制增殖作用。结论:1.DADS可明显抑制人胶质瘤U251细胞增殖。2.DADS可诱导人胶质瘤U251细胞RORα蛋白表达上调。3. miR-RORα表达载体(pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-RORα)转染细胞后可明显抑制RORα表达。4.干扰至RORα表达明显下调后,可促进U251细胞增殖,并且抑制RORα表达可削弱DADS对U251细胞的增殖抑制作用,说明RORα参与DADS抗U251细胞增殖的作用。