背景与目的：乙醇对大脑有神经毒性作用,进入神经系统后可对细胞产生直接毒性作用。乙醇能引起神经行为的改变,随着血中乙醇浓度的升高,人的注意力、判断力及辨别力均会不同程度受损,而可能引发各种刑事案件和民事案件,因此很有必要对乙醇与机体的作用进行深入的研究。本研究用不同浓度乙醇作用原代培养大鼠皮质神经细胞后,采用倒置显微镜、HE染色及扫描电镜观察皮质神经细胞形态的改变；采用免疫组化SP法,研究皮质神经细胞CYP2E1、iNOS和NSE表达的时序性变化,探讨它们之间的相互关系以及参与脑损伤的机理。方法：1、采用清洁级新生SD大鼠(出生后24h内),分离大脑皮质,进行体外培养,采用免疫组化SP法进行皮质神经细胞的纯度鉴定,选择皮质神经细胞纯度高、生长状态良好的细胞随机分为对照组及低、中和高剂量组。低、中和高剂量组在培养液中加入无水乙醇,使培养液中乙醇浓度分别为0.5g/L、1.5g/L和3.0g/L；对照组在培养液中加入等量生理盐水。分别处理皮质神经细胞30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h。2、通过HE染色法观察不同浓度乙醇作用下、不同时间点原代培养大鼠皮质神经细胞形态的改变。3、通过扫描电镜观察不同浓度乙醇作用下、不同时间点原代培养大鼠皮质神经细胞形态的改变。4、采用免疫组化SP法研究不同浓度乙醇作用下、不同时间点原代培养大鼠皮质神经细胞CYP2E1、iNOS和NSE表达的变化。5、统计分析：所有数据均用x±s表示,用SPSS12.0统计软件对数据进行单因素方差分析,采用LSD进行两两比较,检验水准α=0.05。结果：1、大鼠皮质神经细胞的原代培养：皮质神经细胞在培养第9d分化成熟,倒置显微镜下可见细胞胞体饱满,折光性强,胞核位于细胞中央或偏于一侧,胞核及核仁清晰可见,细胞突起长度明显增长,突起粗大并交织成网状。2、大鼠皮质神经细胞的纯度鉴定：NSE免疫细胞化学染色后,阴性对照可见细胞浆及突起呈淡蓝色,阳性反应可见细胞浆及突起呈棕黄色。计算出每个视野中阳性细胞数与细胞总数的平均比值为90%,即神经细胞纯度为90%。3、乙醇作用后皮质神经细胞倒置显微镜下的表现：0.5g/L乙醇作用后,各时间点细胞形态改变与对照组基本相同。1.5g/L乙醇作用8h后,细胞形态发生改变,细胞呈梭形或长梭形,胞浆内可见圆形空泡。3.0g/L乙醇作用后,随着乙醇浓度和作用时间增加,细胞形态发生明显改变,细胞肿大变圆,细胞浆内圆形空泡增多,细胞突起变短明显,细胞核肿大或消失,细胞问连接消失。4、乙醇作用后皮质神经细胞HE染色结果：0.5g/L乙醇作用后,各时间点细胞的形态改变与对照组基本相同。1.5g/L乙醇作用8h后,细胞形态发生改变,可见细胞胞体肿大、变圆,细胞浆内出现空泡,胞核不规则淡染。3.0g/L乙醇作用后,随着乙醇浓度和作用时间的增加,细胞形态发生明显改变,细胞肿大变圆,细胞浆内出现大量空泡；部分细胞胞体变小、深染、或呈三角形,细胞浆红染加深,细胞核小而深染,核仁不明显,细胞间连接消失。5、乙醇作用后皮质神经细胞扫描电镜观察结果：0.5g/L乙醇作用后,各时间点细胞形态改变与对照组基本相同。1.5g/L乙醇作用8h后,细胞形态发生改变,部分细胞胞体呈梭形、长梭形或不规则形,突起变短明显；少数细胞胞体表面的树突棘形态发生改变,胞体局部失去与其他细胞的连接。3.0g/L乙醇作用后,随着乙醇浓度和作用时间的增加,细胞形态发生明显改变,细胞胞体肿大变圆,部分细胞呈不规则形,突起变短；随着作用时间增加,表面呈凹陷状、不规则形的细胞逐渐增多,突起变短明显,部分细胞树突棘的形态发生改变；最后大部分细胞塌陷呈平铺状,细胞突起消失,细胞之间的连接消失。6、乙醇作用后皮质神经细胞内CYP2E1、iNOS和NSE的表达结果：(1) CYP2E1的表达结果：对照组皮质神经细胞内CYP2E1只有轻度表达；0.5g/L乙醇作用后皮质神经细胞内CYP2E1的表达稍有增强；1.5g/L乙醇作用后,皮质神经细胞内CYP2E1表达逐渐增强,2h时CYP2E1表达开始增强,12h时CYP2E1表达最强,24h时CYP2E1表达仍高于正常；3.0g/L乙醇作用后,皮质神经细胞内CYP2E1表达逐渐增强,1h时CYP2E1表达开始增强,8h时CYP2E1表达最强,随后表达逐渐下降,24 h时CYP2E1表达仍高于正常。(2)iNOS的表达结果：对照组皮质神经细胞内iNOS只有极轻度表达；0.5g/L乙醇作用后皮质神经细胞内iNOS的表达稍有增强；1.5g/L乙醇作用后,皮质神经细胞内iNOS表达逐渐增强,2h时iNOS表达开始增强,12h时iNOS表达最强,随后表达逐渐下降,24h时iNOS表达仍高于正常；3.0g/L乙醇作用后,皮质神经细胞内iNOS表达逐渐增强,1h时iNOS表达开始增强,8h时iNOS表达最强,随后表达逐渐下降,24 h时iNOS表达仍高于正常。(3)NSE的表达结果：对照组皮质神经细胞内NSE呈强阳性表达；0.5g/L乙醇作用后皮质神经细胞内NSE的表达稍减弱；1.5g/L乙醇作用后,皮质神经细胞内NSE表达逐渐下降,2h时NSE表达开始下降,12h时NSE表达最弱；3.0g/L乙醇作用后,皮质神经细胞内NSE表达下降比较快,1h时NSE表达开始下降,8h时NSE表达最弱。结论：1、不同浓度乙醇作用原代培养大鼠皮质神经细胞后,倒置显微镜和光镜下发现,中、高浓度乙醇短时间内即能导致皮质神经细胞的形态发生改变。2、扫描电镜下观察发现,中、高浓度乙醇能对皮质神经细胞造成损伤,导致皮质神经细胞的形态发生改变,同时与作用时间密切相关。3、乙醇作用皮质神经细胞后,CYP2E1和iNOS的表达随着乙醇浓度和作用时间的增加而增强,而NSE的表达则逐渐下降；三者表达的时序性变化基本一致,在法医学检验及鉴定中,可联合起来推断乙醇的作用时间。