鸦葱（Scorzonera austriaca Willd.）,又名菊牛蒡、土参、少立菜等,为菊科鸦葱属多年生草本植物,分布于西北,东北地区,并且广泛应用于治疗发烧、红肿、消肿和乳腺炎。鸦葱中已经分离出来的主要化学成分有黄酮、倍半萜、三萜、香豆素类化合物。其中黄酮类物质广泛存在于各种植物中,具有多种生理活性包括抗菌、抗氧化、抗炎和抗癌等。在前期实验中,我们初步确定了鸦葱粗制总黄酮具有肝保护作用,然而,由于存在着鸦葱粗制总黄酮的纯度低,保肝机制以及在体内分布情况不清楚等问题,需进一步深入验证与阐明。除此之外,关于鸦葱总黄酮的药物代谢动力学及组织分布尚未报道。因此本篇论文对鸦葱总黄酮进行提取纯化,制备出精制总黄酮以及6个黄酮类化合物,然后主要通过体内与体外实验对其肝保护作用机制及其在大鼠体内药物代谢动力学及组织分布等方面进行了一系列研究。研究内容如下:1.鸦葱精制总黄酮的提取及黄酮类单体化合物的制备:目的:从鸦葱全草中提取纯化后得到精制总黄酮（FSA）,并且制备出黄酮类单体化合物。方法:采用乙醇浸泡法得到鸦葱提取物,用D101、D4020大孔树脂色谱柱通过两步分离纯化得到鸦葱精制总黄酮;再通过薄层色谱法、硅胶柱层析法、HPLC半制备法制备出黄酮类单体化合物并对其进行鉴定。结果:D4020大孔树脂对鸦葱粗制总黄酮表现出良好的吸附和解析,得到的精制总黄酮的纯度达到了92.5%。并由精制总黄酮制备出六种黄酮类单体化合物,名称具体如下:1:异荭草素（isoorientin）2:荭草素（orientin）3:2′′-O-β-D-吡喃木糖基异荭草素（2′′-O-β-D-xylopyranosyl isoorientin）4:2′′-O-β-D-吡喃木糖基异牡荆素（2′′-O-β-D-xylopyranosyl isovitexin）5:6-C-L-α-吡喃阿拉伯糖基牡荆素（6-C-l-α-arabipyranosyl vitexin）6:牡荆素（vitexin）2.鸦葱精制总黄酮对于CCl₄诱导的急性肝损的体内与体外的肝保护作用机制的研究目的:通过对ICR（Institute of Cancer Research）小鼠腹腔注射0.15%CCl₄橄榄油溶液,诱导急性化学性肝损伤,同时对小鼠采用灌胃给药方式给予不同剂量的鸦葱精制总黄酮溶液,给药剂量分别为低剂量组（60 mg/kg）、中剂量组（100 mg/kg）、高剂量组（140 mg/kg）。将小鼠处死后,检测小鼠体内相关的生物活性酶、生化指标和其它特异性蛋白表达水平的变化,以此来探究鸦葱精制总黄酮对CCl₄致肝损伤的保护作用及相关机制。除此之外,利用L02细胞进行体外实验,进一步验证体内实验的结果。方法:将ICR小鼠随机分为6组,每组10只,其中空白对照组和模型组灌胃0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液,灌胃7天,每天一次,其他剂量组每天按设定剂量灌胃给药。最后一次给药2 h后,除空白组外,其余各组按照10 mL/kg腹腔注射0.15%CCl₄橄榄油溶液,空白对照组腹腔注射橄榄油。16 h后眼球取血,检测血清中丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（aspartate transaminase,AST）以及乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）的含量;取血后将小鼠处死,取部分肝脏组织进行10%甲醛固定,用于HE染色分析;另取部分肝组织匀浆处理后,检测组织中超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）、谷胱甘肽酶（glutathione,GSH）和丙二醛（malonaldehyde,MDA）;同时,L02细胞经预处理后,与部分肝组织进行提取蛋白后,用于Western-Blot实验,检测相关的特异性蛋白表达情况;剩余的肝脏组织储存至-80℃冰箱中。结果:1.小鼠血清中生化指标的检测:模型组与空白对比,ALT、AST和LDH的含量均显著升高,说明了小鼠肝损伤模型建立成功,而给予鸦葱精制总黄酮的三个剂量组后,均能够降低血清中ALT、AST和LDH的含量（p<0.05）,并且具有一定的剂量依赖性;2.小鼠肝脏组织中酶的检测:相较于空白组,模型组中SOD与GSH的含量显著降低,MDA的含量升高明显,表明小鼠体内出现氧化应激反应,脂质类物质的大量表达,说明了小鼠肝损伤模型建立成功,而给予鸦葱精制总黄酮的三个治疗组,均能够提高SOD与GSH的表达,降低MDA的积累,且具有一定的剂量依赖性;3.小鼠肝组织结构的变化:空白组的小鼠肝组织结构正常,模型组相较于正常组肝小叶界限不清,肝细胞条索状结构消失,多处可见肝细胞空泡变性中,部分肝细胞嗜酸性变及核固缩、碎裂甚至坏死,表明了肝脏组织受到了严重损害,而鸦葱精制总黄酮给药组相较于模型组则出现了明显的改善,肝小叶结构基本完整,只有部分的肝细胞空泡变性;4.小鼠肝组织与L02细胞中特异性蛋白的表达:与空白组比较,模型组的炎症蛋白TLR4,TNF-α,P-P65和IL-6表达均升高,自噬蛋白LC3升高、蛋白P62表达降低。而鸦葱精制黄酮给药组能降低炎症蛋白的表达。同时,细胞中自噬抑制剂组中抑制自噬后,细胞存活率降低,且保护作用减弱,进一步证明了鸦葱黄酮给药组通过激活自噬反应从而提高自噬蛋白的表达,起到对肝组织具有较好的改善作用;结论:鸦葱精制总黄酮具有显著的保肝活性,可以作为一种潜在用于抗化学性肝损伤的治疗药物。3.鸦葱精制总黄酮的体内药物代谢动力学及组织分布研究目的:建立一种可以快速、灵敏且同时定量大鼠血浆及组织中6个黄酮化合物的LC-MS/MS方法,并经过方法学验证以用于该化合物经灌胃给药和静脉注射给药在体内的药物动力学及组织分布研究。方法:灌胃给药组药动学研究:取Wistar大鼠15只,将大鼠随机分为3组（每组5只）,灌胃给予鸦葱精制总黄酮提取物,给药剂量分别为低剂量组（42 mg/kg）、中剂量组（70 mg/kg）、高剂量组（98 mg/kg）。分别于给药前和给药后5 min,10 min,15 min,30 min,45 min,1 h,1.5 h,2 h,3 h,5 h,7 h,9 h,12 h和24 h于眼底静脉丛采血0.25 mL,置肝素化离心管中,在1520×g（离心力）下离心10分钟,分离血浆,并保存在-20℃。取各采血点血浆50μL,沉淀蛋白、进行血浆样品处理,取上清液转移至1.5 mL离心管中,放置于45oC水浴,氮气流吹干。所得残渣用80μL流动相（乙腈-0.1%甲酸,20︰80,v/v）复溶,进样10μL进行LC-MS/MS分析。静脉注射组药动学研究:取Wistar大鼠15只,将大鼠随机分为3组（每组5只）,尾静脉注射鸦葱精制总黄酮提取物,给药剂量分别为低剂量组（4 mg/kg）、中剂量组（8 mg/kg）、高剂量组（16 mg/kg）。之后按照“灌胃给药组药动学研究”方法进行后续实验。灌胃给药组组织分布研究:取Wistar大鼠30只,分成6组实验,每组5只。试验前禁食12 h,自由饮水,给药后4 h即可喂食。灌胃给予鸦葱精制总黄酮提取物（70 mg/kg）,在5 min、30 min、1 h、3 h、5 h和7h眼底静脉丛取血后,将大鼠立即脱颈椎处死。之后用手术剪解剖,取其肝、心、脾、肺、胃、肾、脑组织,于生理盐水中清洗干净,用滤纸将组织吸干后称重,同时分别记录其重量,与生理盐水按照g:mL=l︰10的比例混合后匀浆,得到各组织匀浆样品,于-20oC冰箱中保存,直到进行LC-MS/MS分析。取各组织匀浆液50μL,沉淀蛋白、进行血浆样品处理,取上清液转移至另一个1.5 mL离心管中,放置于45oC水浴经氮气流吹干。所得残渣用80μL流动相（乙腈-0.1%甲酸,20︰80,v/v）复溶,进样10μL进行LC-MS/MS分析。静脉注射组组织分布研究:取Wistar大鼠30只,分成6组实验,每组5只。试验前禁食12 h,自由饮水,给药后4 h即可喂食。尾静脉注射鸦葱精制总黄酮提取物（8 mg/kg）,在5 min、30 min、1 h、3 h、5 h和7h眼底静脉丛取血后,立即脱颈椎处死。之后按照“灌胃给药组组织分布研究”方法进行后续实验。数据分析:通过DAS2.1软件计算药物动力学参数,包括:药时曲线下面积(AUC_0-t)和(AUC_0-∞)、消除半衰期(t_1/2)、平均滞留时间（MRT）、最大血药浓度C_max等,对每个大鼠血浆中的所有分析物的浓度与时间数据进行分析,所有参数均用mean±SD表示,组织分布柱状图使用软件进行统计分析。结果:根据我们已建立的LC-MS/MS方法,研究了大鼠灌胃给药和静脉注射鸦葱精制总黄酮提取物后6个化合物的药物代谢动力学及组织分布。各化合物的C_max和AUC_0-t与给药剂量呈良好的线性相关。其中,灌胃给药中化合物2和化合物6低、中剂量组没有检测出,可能与黄酮类化合物灌胃给药的生物利用度较低有关。组织分布研究中发现各化合物均可快速地、广泛地分布于肾、肺、胃、肝等血液充盈组织中,且无蓄积。此外各化合物在脑组织中的浓度最低,表明黄酮类苷类化合物很难透过大鼠的血脑屏障。除此之外,无论是静脉注射给药还是灌胃给药,化合物4在肝脏中的含量较高,因此结合体内的实验结果,为我们下一步进行鸦葱黄酮单体化合物的活性试验提供了实验依据与理论基础。结论:本实验所建立的LC-MS/MS方法可用于鸦葱总黄酮的药物动力学及组织分布研究。