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蠕虫埃斯特菌(Esteya vermicola)是一种能够寄生松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)的食线虫真菌,在实验室条件下对松材线虫具有很强的侵染力,具有潜在的生防价值。本研究采用同源克隆结合RACE的方法,从该菌菌株NKF 13222克隆到一个丝氨酸蛋白酶基因Evsp(GenBank登录号KP698922)。该基因cDNA全长为2280 bp,开放阅读框长1656 bp,预测编码551个氨基酸,其与枯草杆菌蛋白酶家族催化结构域的氨基酸序列具有高度的相似性,在氨基酸水平上高度保守。Evsp gDNA包含长度分别为396 bp和1260 bp的2个外显子和一个长度为207 bp的内含子,且外显子与内含子之间切割位点符合’GT-AG’剪切规律。Southern blot分析表明,Evsp基因在蠕虫埃斯特菌基因组中以单拷贝的形式存在。基于丝氨酸蛋白酶氨基酸序列的系统发育分析,揭示蠕虫埃斯特菌与内寄生真菌、机会真菌、产毒真菌及昆虫病原真菌亲缘关系较近,而与捕食线虫真菌亲缘关系较远。通过RT-PCR方法扩增了Evs胡成熟肽的cDNA序列,构建了重组表达质粒Evsp-pET28a,转化至大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导表达。SDS-PEAG分析揭示表达产物在大肠杆菌细胞内以不可溶性的包涵体形式存在,包涵体经变性、复性及纯化后,获得了的重组丝氨酸蛋白酶rEvsp。用福林酚法检测发现rEvsp能有效酶解酪蛋白,且rEvsp能降解并破坏松材线虫体壁,推测丝氨酸蛋白酶在蠕虫埃斯特菌侵染线虫过程中可能起到重要作用。利用重叠延伸PCR技术构建了Evsp基因的同源重组片段,通过PEG介导的原生质体转化法,将约3.6 kb的线性融合片段转化进蠕虫埃斯特菌,PCR检测和Southern blot都验证了基因缺失突变体菌株ES84的成功构建。比较ES84菌株和野生型菌株NKF 13222的粘性分生孢子对松材线虫的粘附能力和侵染能力,发现两菌株对松材线虫的粘附率和侵染率没有显著差异,推测蠕虫埃斯特菌的丝氨酸蛋白酶在基因功能上存在冗余性。本研究为揭示蠕虫埃斯特菌侵染松材线虫的分子机制及进一步研究丝氨酸蛋白酶Evsp的生物学功能奠定了基础。