大肠癌在世界范围是第三大常见恶性肿瘤，在发达国家占第二位。近年来，我国大肠癌死亡率在大城市位居第四位，在农村位居第五位，而且发病率和死亡率呈逐年上升趋势，发病年龄明显提前。过去50年来大肠癌根治术后生存率无明显变化，50％患者术后因局部复发或转移而最终死亡。死因与分期较晚和是否合理选择治疗方法有直接关联。迄今为止大肠癌术前分期尚没有理想的方法，一些常用的检查方法如超声、MRI、CT也不能准确分期。而术前准确地了解肿瘤侵犯范围对于临床医师选择手术方式和制定合理的综合治疗计划非常重要。术前分期被认为是前瞻性评价原发病灶范围，正确选定综合治疗方案、进行新辅助治疗及预测根治性手术后生存率和正确制定术后随访计划最关键的因素。手术后的局部复发和远处转移是大肠癌根治术后治疗失败的主要原因。因此深入对大肠癌局部复发、远处转移的研究，对提高其预后水平具有重要的现实意义。肝转移是大肠癌根治性切除后死亡的主要原因，大肠癌患者出现肝转移并不意味着失去治愈机会，手术切除目前仍然是保证长期生存的惟一手段，目前对于大肠癌术后肝转移的早期诊断亦尚没有理想的方法。现有的大肠癌肿瘤标志物如CEA、CA199等对指导大肠癌分期没有帮助，对大肠癌复发和转移的监测以及肝转移监测中普遍存在灵敏度和特异度低的问题，因此，寻找灵敏、特异、检测方便的新肿瘤标志物已成为基础研究向应用研究过渡的热点之一，对于临床指导治疗，提高预后具有重大意义。由于蛋白质而并非核酸才是生命活动的具体执行者和体现者，蛋白质组学能够识别鉴定细胞、组织或机体的全部蛋白质，提供一组蛋白质的功能及其模式的信息，能够同时反映细胞内部的遗传特性和外界因素的影响的结果。因此寻找特异、灵敏的标志物用于术前分期和术后随访监测等，客观上要求在蛋白质组的水平进行进一步探索。表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱(surface-enhanced laser desorption／ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)是近年来发展起来的一种全新的蛋白质组学研究手段，该方法相比其他传统蛋白质组学研究方法，具有能够直接对临床标本进行检测，实现了质谱技术高通量的用于临床样本检测的优点。生命科学的迅猛发展使人们从基因组学、蛋白质组学等研究领域中收获了大量的数据，仅仅依靠传统的数理统计手段是很难胜任的，生物信息学的发展为收集、存储、分析其数据，并从中获取有用的生物学信息提供了重要的手段。课题旨在应用SELDI蛋白质指纹图谱和生物信息学技术从血清中筛选大肠癌蛋白质肿瘤标志物并构建术前分期检测模型；寻找术后监测差异蛋白：构建术后肝转移检测模型：建立组织蛋白质指纹图谱的检测方法从而寻找大肠癌／正常大肠组织间的差异表达蛋白质。以期找到适合大肠癌术前分期、术后复发转移监测的候选肿瘤标志物，寻找组织特异性差异表达蛋白，为探索大肠癌发病机制提供新思路。第一部分血清蛋白质指纹图谱在大肠癌术前分期中的研究采用SELDI-TOF-MS技术及其配套CM10蛋白质芯片检测76例术前大肠癌患者(按UICC1997 TNM分期标准，其中Ⅰ期10例，Ⅱ期19例，Ⅲ期16例，Ⅳ期31例)的血清蛋白质指纹图谱，Mann-Whitney秩检验比较各组血清蛋白质质谱数据，寻找各组之间表达有差异的蛋白质峰。大肠癌各期患者术前血清蛋白质质谱比较的数据导入Matlab6.5数据处理软件的SVM、判别分析软件。选择两组间差别最显著的10个蛋白质峰数据进行分析。筛选出Youden指数最高的秩和比峰组合，用SVM留一法和判别分析留一法建立分期模型。最后同时输出SVM、原始判别及二者交叉验证的结果，并应用时间序列分析的方法将Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ各期以二维散点图的形式表示。最后选用判别分析留一法，并应用时间序列分析的方法将Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ各期以二维散点图的形式表示。6个蛋白质峰[2760、2965、2048、4796、4140和37762质荷比(m／z)]组合所构建的诊断模型Ⅰ鉴别局限性大肠癌(Ⅰ、Ⅱ期)和区域性(Ⅲ期)大肠癌患者的总准确率86.67％(39／45)；3个蛋白质峰[6885、2058和8568质荷比(m／z)]组合所构建的诊断模型Ⅱ鉴别局限区域性(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期)和系统性大肠癌患者(Ⅳ期)的总准确率75.00％(57／76)。诊断模型Ⅲ鉴别Ⅰ期和Ⅱ期大肠癌患者的准确率86.21％(25／29)；模型Ⅳ鉴别Ⅰ期和Ⅲ期大肠癌的准确率84.62％(22／26)；模型Ⅴ鉴别Ⅱ期和Ⅲ期大肠癌的准确率85.71％(30／35)；模型Ⅵ鉴别Ⅱ期和Ⅳ期大肠癌的准确率80.00％(40／50)；模型Ⅶ鉴别Ⅲ期和Ⅳ期大肠癌患者的总准确率78.72％(37／47)。Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ各期的二维散点图，可以明显看出各期之间的区别。该方法可以较好地应用于大肠癌的术前分期；该方法所筛选的候选肿瘤标志物可以指导大肠癌综合治疗。第二部分血清蛋白质指纹图谱在大肠癌术后随访中的研究随访72例术后大肠癌患者，完成其血清蛋白质指纹图谱的检测。初步分析血清蛋白质指纹图谱在大肠癌术后监测早期发现复发或转移病灶中的价值。大肠癌术后患者共72例，无复发、转移者30例，有复发、转移者42例，随访时间：2002年4月至2005年4月。中位随访时间16个月。检测该76例血清的蛋白质指纹图谱，用Biomarker Wizard 3.2.0软件比较其蛋白质指纹图谱，得到11个蛋白质峰的表达差异有统计学意义，其中有6个蛋白质峰(44888、5908、28092、5341、2957和8566m／z)在大肠癌术后复发转移中表达低于无复发转移的患者(P＜0.05)，5个蛋白质峰(2107、6114、2131、2162和2389m／z)在大肠癌术后复发转移中表达高于无复发转移的患者(P＜0.05)；应用SPSS12.0统计软件进一步计算这11个表达差异有统计学意义(P＜0.05)的蛋白质峰的ROC曲线下面积(AUC)，结果其中2个峰(44888和5908m／z)的AUC值大于0.07。所筛选出的差异蛋白质峰，对于临床指导监测大肠癌术后复发转移，具有一定意义。第三部分血清蛋白质指纹图谱在大肠癌术后监测肝转移中的应用在42例大肠癌术后有复发转移的病人中，19例仅有肝转移、7例肝转移伴其余部位转移、16例无肝转移但有其余部位转移以及30例术后无复发转移患者。分析其血清蛋白质指纹图谱，应用支持向量机留一法筛选出监测大肠癌肝转移的候选标志物，筛选出4个蛋白质峰[6199，5482，9295和2872质荷比(m／z)]组合所构建的模型1鉴别大肠癌单独肝转移患者及肝转移伴其余部位转移患者总准确率92.31％(24／26)；4个蛋白质峰[6199，3419，2399和2127质荷比(m／z)]组合所构建的模型2鉴别大肠癌单独肝转移患者和有其余部位转移患者的总准确率83.33％(35／42)；4个蛋白质峰[2208，2299，2355和2758质荷比(m／z)]组合所构建的模型3鉴别大肠癌术后无复发转移和单独肝转移的总准确率87.76％(43／49)。M／Z为6199的蛋白质在大肠癌肝转移组中的丰度明显高于其余部位转移者(P＜0.05)，可以用来监测患者转移部位。2208，2299，2355和2758在大肠癌肝转移后其丰度明显高于无瘤生存组，提示可能是与大肠癌术后肝转移相关的标记物。结论一、应用血清蛋白质指纹图谱缜密鉴别大肠癌术前分期。1．6个蛋白质峰[2760、2965、2048、4796、4140和37762质荷比(m／z)]组合所构建的诊断模型Ⅰ鉴别局限性大肠癌(Ⅰ、Ⅱ期)和区域性(Ⅲ期)大肠癌患者的总准确率86.67％(39／45)。2．3个蛋白质峰[6885、2058和8568质荷比(m／z)]组合所构建的诊断模型Ⅱ鉴别局限区域性(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期)和系统性大肠癌患者(Ⅳ期)的总准确率75.00％(57／76)。3．诊断模型Ⅲ鉴别Ⅰ期和Ⅱ期大肠癌患者的准确率86.21％(25／29)；模型Ⅳ鉴别Ⅰ期和Ⅲ期大肠癌的准确率84.62％(22／26)；模型Ⅴ鉴别Ⅱ期和Ⅲ期大肠癌的准确率85.71％(30／35)；模型Ⅵ鉴别Ⅱ期和Ⅳ期大肠癌的准确率80.00％(40／50)；模型Ⅶ鉴别Ⅲ期和Ⅳ期大肠癌患者的总准确率78.72％(37／47)。4．Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ各期的二维散点图，可以明显看出各期之间的区别。二、应用血清蛋白质指纹图谱筛选出大肠癌术后复发转移的候选标志物1．得到11个蛋白质峰的表达差异有统计学意义2．其中有6个蛋白质峰(44888、5908、28092、5341、2957和8566m／z)在大肠癌术后复发转移中表达低于无复发转移的患者(P＜0.05)，5个蛋白质峰(2107、6114、2131、2162和2389m／z)在大肠癌术后复发转移中表达高于无复发转移的患者(P＜0.05)。3．进一步计算这11个表达差异有统计学意义(P＜0.05)的蛋白质峰的ROC曲线下面积(AUC)，结果其中2个峰(44888和5908 m／z)的AUC值大于0.07。三、应用血清蛋白质指纹图谱鉴别大肠癌根治术后肝转移：1．筛选出4个蛋白质峰[6199，5482，9295和2872质荷比(m／z)]组合所构建的模型1鉴别大肠癌单独肝转移患者及肝转移伴其余部位转移患者总准确率92.31％(24／26)。2．筛选出4个蛋白质峰[6199，3419，2399和2127质荷比(m／z)]组合所构建的模型2鉴别大肠癌单独肝转移患者和有其余部位转移患者的总准确率83.33％(35／42)。3．筛选出4个蛋白质峰[2208，2299，2355和2758质荷比(m／z)]组合所构建的模型3鉴别大肠癌单独肝转移和无复发转移者的总准确率87.76％(43／49)。4．m／z为6199的蛋白质在大肠癌肝转移组中的丰度明显高于其余部位转移者(P＜0.05)，可以用来监测患者转移部位。2208，2299，2355和2758质荷比(m／z)在大肠癌肝转移后其丰度明显高于无瘤生存组，提示可能是与大肠癌术后肝转移相关的标记物。