帕金森病(PD)是以黑质多巴胺能神经元选择性进行性丢失为病理特征的神经变性疾病,其发生与黑质纹状体中多巴胺含量减少有关。随着人口老年化的到来,其患病率逐年增高,已成为仅次于老年性痴呆的神经系统第二大变性疾病。目前在我国65岁以上老年人群中,帕金森病的患病率为1.7%,与发达国家相近,给社会造成了沉重的经济负担和严重影响着老年人的生活质量。但是帕金森病的病因至今未明,研究提示可能与年老、环境因素及遗传因素有关,其发病机制也涉及自由基、氧化应激、谷氨酸兴奋性毒性、线粒体复合物I缺失、神经慢性炎症、神经营养因子缺乏和凋亡等,在级联生化反应中这些机制相互作用最终导致神经元死亡。但确切的发病机制尚不清楚。药物治疗是应用最广泛的帕金森病治疗手段,但已有的抗帕金森病药物只能改善症状,不能延缓疾病进程,且长期应用会有严重的毒副作用。因此急需找到更为有效的防治手段。流行病学调查观察到非类固醇类抗炎药可降低远期帕金森病发病风险的现象。目前,在许多神经炎症及神经变性疾病可以观察到变性的神经元周围有激活的小胶质细胞积聚。由于小胶质细胞的过度活化导致炎症和氧化应激的发生而损伤多巴胺能神经元,是PD的重要发病机制。许多神经变性疾病包括AD和PD疾病进程中神经炎症被认为是关键的发病机制。几个研究均发现激活的小胶质细胞能释放神经破坏家族或神经毒性致炎细胞因子,包括NO、TNFα、PGE2、IL-1β和IL-6。这些促炎症细胞因子能在神经炎症进程中经由受体依赖的细胞凋亡途径加重神经元的损伤。因此,可能有效的治疗策略就是抑制包括小胶质细胞在内的炎症反应过程起到神经保护作用。但小胶质细胞的激活途径及其释放炎症因子在帕金森病发病过程中所起的作用尚存在争论。Toll样受体(TLRs)是一类细胞表面信号传导跨膜受体,属于I类跨膜受体,它不仅在天然免疫系统中识别病原微生物、激活先天性免疫应答,是天然免疫系统识别病原微生物的主要受体；而且还使抗原提呈细胞识别病原体、产生共刺激信号而启动获得性免疫反应,是人体先天免疫和后天获得性免疫的桥梁。现有的研究提示TLRs与神经变性疾病有关。Miguel等的最新研究结果提示Toll样受体4(TLR4)诱导了小胶质细胞的活化。因此我们认为：抑制对于小胶质细胞的活化诱导的炎症介质的释放起到的神经保护作用远比保护神经元本身更重要。以上证据充分证明神经炎症作为帕金森病的一大发病机理,小胶质细胞的激活和释放炎症介质起到关键的作用。根据国外最新研究理论推断,TLR4可能是神经炎症触发通路的关键受体。那么我们可以设想抑制TLR4的表达,是否可以抑制小胶质细胞活化和后续的炎症介质的释放,从而阻断PD的发生或发展呢?基于这个理论,我们设计在帕金森病小鼠经典模型中检测TLR4、多巴胺能神经元、小胶质细胞的含量,并且检测相关的炎症介质如TNF-α和IL1β等的表达量,通过特异性TLR4的抗体抑制TLR4表达,分析其对炎症介质TNF-α和IL1β等表达的影响,同时对比加用抗体组与不加抗体组小鼠行为学、黑质纹状体中多巴胺神经元及小胶质细胞激活状态变化,最终揭示抗TLR4是否为一个关键的抗炎手段,对帕金森病小鼠是否有延缓病情发展和缓解症状的功效,同时希望明确早期检测TLR4的活化是否对帕金森病有预测作用。第一章MPTP诱导的帕金森病小鼠模型及其评价方法的确立稳定的帕金森动物模型及高效的评价方法对于研究帕金森病至关重要。帕金森病的动物模型大体分为三类：A：毒剂诱导模型,B：基因模型,C：多巴胺能神经元特异性基因敲除模型。尽管这些模型各有利弊,但因为帕金森病患者临床症状的复杂性,至今仍没有哪一种模型能够完全复制帕金森病的所有特征。临床研究最常用的模型是1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)毒剂诱导模型,但其评价方法各异。为了进一步确立稳定的动物模型和高效的评价方法,我们将雄性C57BL/6J小鼠48只,随机分为正常对照组(组1)、MPTP组(组2)和TLR4抗体+MPTP组(组3),每组各16只。组2和组3腹腔注射MPTP的剂量为30mg/Kg/次,液体注射量为10ml/Kg/次,1次/天,连续注射7天,正常对照组注射等体积的生理盐水。每次注射完毕后,观察各组小鼠是否出现不自主震颤、流涎、行动迟缓、姿势不稳、肢体发僵、毛发和尾巴竖起等短期症状。以及有无整体主动性下降,包括进食能力和活动等,和运动迟缓、步态不稳、动作笨拙、弯腰弓背、前爪运动不协调等持续症状。为了让小鼠适应实验室条件,尽量避免其他因素对实验结果的干扰,把小鼠于实验前2小时从饲养室移至行为学检测室。制作帕金森病模型前2天,对小鼠行小鼠滚筒仪训练,以尽量减少因学习快慢的差异导致实验误差的出现。小鼠滚筒仪是用来评价小鼠的运动协调能力。每天训练测试2次,转速为12r.min,训练时间120s,记录每只小鼠从滚筒开始旋转到离开滚筒的时间作为小鼠运动跌落潜伏期。给药结束后1天开始正式小鼠滚筒仪实验。正式实验时转速调为24r.min,测试时间为360s。每只小鼠重复测定3次取平均值。所有测试完毕后每组随机选取8只小鼠行心脏灌注固定后,取全部大脑,用于病理切片检测各组小鼠中脑TH阳性细胞的形态和数量。所有数据采用SPSS 16.0统计学软件处理,计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示,检验水准a=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。各组小鼠的中脑多巴胺神经元及小鼠滚筒仪跌落潜伏期的差异性比较：如果方差齐就采用单因素方差分析,组间多重比较采用Bonferroni法；如果方差不齐则采用稳健的Welch检验,组间多重比较采用Tamhane’T2法。结果发现MPTP注射后2分钟,C57BL/6J小鼠开始显得躁动不安,在笼内来回奔跑或爬高,出现细小静止性震颤以及下颌呈点头状震颤、立毛反应等。大约10分钟后开始蜷缩成团,出现运动减少,此时皮毛散乱,目光呆滞,竖毛、弓背、竖尾明显,对外界刺激反应降低或根本无反应。以上急性中毒反应大约4小时后开始减弱,24小时后基本消失,但运动仍减少。从MPTP开始注射第5天,小鼠开始出现整体主动性下降,包括进食能力和活动等,并且出现运动迟缓、步态不稳、动作笨拙、弯腰弓背、前爪运动不协调等持续症状。客观定量检测运动协调能力发现对照组小鼠的跌落潜伏期明显比其他各组长,MPTP组小鼠跌落潜伏期最短,Anti-TLR4+MPTP组次之,三组之间比较有显著性差异(F=970.707,P<0.001)。说明MPTP诱导的帕金森病小鼠模型运动协调能力明显受损。三组中脑TH阳性多巴胺神经元含量差异有统计学意义(F=97.406,P<0.001),各组两两比较差异有显著性(P<=0.001)。MPTP组小鼠中脑黑质TH阳性多巴胺能神经元数量明显比正常对照组减少。用高倍镜观察,可见多巴胺能神经元细胞数量少,细胞体积小,细胞质染色变浅,神经突起变短。根据本研究我们得出结论：MPTP诱导的帕金森亚急性小鼠模型临床表现与帕金森病患者相似,免疫组化显示明显的黑质区多巴胺能神经元丢失,符合帕金森动物模型的要求。小鼠滚筒仪测试可以较客观评价帕金森动物模型的运动症状。第二章帕金森病小鼠模型TH、TLR4、CDllb和炎症介质的表达及TLR4抗体对其表达的影响为了进一步验证TLR4受体在帕金森病小鼠发病过程中的作用及其抗体对TH、TLR4、CDllb和炎症介质表达的影响,我们仍按照第一部分实验方案将雄性C57BL/6J小鼠48只,随机分为正常对照组(组1)、MPTP组(组2)和TLR4抗体+MPTP组(组3),每组各16只。组2和组3腹腔注射MPTP的剂量为30mg/Kg/次,液体注射量为10ml/Kg/次,1次/天,连续注射7天,正常对照组注射等体积的生理盐水。由于血脑屏障的客观存在,所以给予小鼠TLR4抗体也要考虑是否能够通过血脑屏障的问题。鉴于目前的观点认为通过鼻饲或侧脑室给药是两个容易通过血脑屏障的简单方法,尽管从大量文献可以看出经鼻腔给药对到达脑内的药物浓度不能充分保证,但我们还是根据文献报道进行了上述两种方法的预实验,并使用In-Vivo FX PRO全自动临床前小动物成像系统对小鼠进行检测,以确认两种给药途径的稳定性及有效性。从小鼠活体成像结果可以发现,C57BL/6J小鼠经鼻饲Anti-Mouse CD284(TLR4)PE后侧脑室基本无红色荧光,说明经鼻腔给药方式效果差,不能保证有效药物浓度；而C57BL/6J小鼠经头部右侧侧脑室注射Anti-Mouse CD284(TLR4)PE后双侧侧脑室有红色荧光,再次证实侧脑室给药能够保证达到中枢神经系统的有效药物浓度,并且注射后小鼠很快恢复正常,对小鼠没有明显的急性损伤反应而且操作方便,实用性好,所以我们选择了侧脑室注射TLR4抗体。组3的C57BL/6J小鼠于注射MPTP前2天开始每天经一侧脑室注射TLR4单克隆抗体20ug/只,连续2天,组1和组2注射等体积的生理盐水。制作PD模型前2天对小鼠行小鼠滚筒仪训练,以尽量减少因学习快慢的差异导致实验误差的出现。在第8天,所有小鼠进行小鼠滚筒仪行为学测试,结束后,每组小鼠随机选取8只断头取脑,快速于冰上取中脑新鲜脑组织用来检测TLR4、TNFa和IL1β的mRNA表达水平。剩下的每组8只小鼠行心脏灌注固定后,取全部大脑组织,用于免疫组化检测各组小鼠中脑TLR4、TH和CD11b阳性细胞的形态和数量。所有数据采用SPSS 16.0统计学软件处理,计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示,检验水准α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。各组小鼠的中脑多巴胺神经元、CD11b含量、中脑腹侧部TLR4mRNA、TNFamRNA、IL1βmRNA表达量及小鼠滚筒仪跌落潜伏期等的差异性比较：如果方差齐就采用单因素方差分析,组间多重比较采用Bonferroni法；如果方差不齐则采用稳健的Welch检验,组间多重比较采用Tamhane’T2法。结果发现三组中脑TH阳性多巴胺神经元含量差异有统计学意义(F=97.406,P<0.001),各组两两比较均有显著性差异(P<=0.001)。对照组明显增高,TLR4抗体+MPTP组次之,MPTP组中脑TH阳性多巴胺神经元数量最少,说明帕金森病小鼠模型造模成功,TLR4抗体干预有效。三组中脑CD11b阳性细胞数量差异显著,有统计学意义(F=131.856,P<0.001),各组两两比较均有显著性差异(P<.001)。MPTP组明显增高,TLR4抗体+MPTP组次之,对照组中脑CD11b阳性细胞数量最少。说明MPTP诱导了小胶质细胞的活化,而TLR4抗体能够部分减少这种活化。三组中脑TLR4阳性细胞数量差异有统计学意义(F=331.758,P<0.001),各组两两比较均有显著性差异(P<0.001).MPTP组明显增高,TLR4抗体+MPTP组次之,对照组中脑TLR4阳性细胞数量最少。三组中脑TLR4mRNA、TNFamRNA和IL1βmRNA表达量差异均有统计学意义(分别为F=36.385, P<0.001; F=299.599, P<0.001; F=40.191, P<0.001), TLR4mRNA和IL1βmRNA表达量各组之间两两比较均有显著性差异(P<0.01), TNFamRNA表达量各组之间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05),均表现为MPTP组明显增高,TLR4抗体+MPTP组次之,对照组最低。说明MPTP诱导了下游促炎症因子的大量释放,并且TLR4参与了这一病理过程,TLR4抗体能够减少这种促炎症因子的释放。因此我们得出结论：TLR4可能是神经变性疾病神经炎症触发通路的关键受体,TLR4受体触发了小胶质细胞的活化并诱导了下游促炎症因子的释放,最终导致多巴胺能神经元的死亡；通过特异性TLR4抗体可以部分阻断MPTP诱导的神经炎症过程,降低小胶质细胞的活化,减少促炎症因子TNFa、IL-1β的表达,减少多巴胺能神经元的死亡,从而部分缓解帕金森小鼠模型的行为学异常；由于我们的研究样本量偏小,还需要进一步扩大样本进行多中心研究,以揭示TLR4通路的药理调节是否成为一个全新的帕金森病治疗手段。总之,本研究发现MPTP诱导的帕金森病亚急性小鼠模型临床表现与帕金森病患者相似,免疫组化显示明显的黑质区多巴胺能神经元丢失,符合帕金森病动物模型的要求。小鼠滚筒仪测试可以较客观评价帕金森病动物模型的运动症状。TLR4可能是神经变性疾病神经炎症触发通路的关键受体,TLR4受体触发了小胶质细胞的活化并诱导了下游促炎症因子的释放,最终导致多巴胺能神经元的死亡。通过特异性TLR4抗体可以部分阻断MPTP诱导的神经炎症过程,降低小胶质细胞的活化,减少促炎症因子TNFα、IL-1β的表达,减少多巴胺能神经元的死亡,从而部分缓解帕金森小鼠模型的行为学异常。更多的研究将揭示TLR4通路的药理调节是否成为一个全新的帕金森病治疗手段。