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油菜（Brassica campestris）是我国的主要油料作物之一,而油菜菌核病（Sclerotinia sclerotiorum）位于油菜三大病害之首。长期以来,我国对油菜菌核病的防治手段主要依靠以多菌灵为代表的苯并咪唑类杀菌剂和以菌核净为代表的二甲酰亚胺类杀菌剂等化学药剂防治。但是由于近年来大面积、长时间的使用,以及多菌灵自身杀菌机制单一等多重原因,使油菜菌核病菌对多菌灵的抗性种群大量产生,导致部分油菜种植区内苯并咪唑类杀菌剂防效的大幅度降低,甚至失效。在以往部分地区的菌核净抗性监测中虽然没有发现大量的抗性菌株,但是仍然在不同的省市发现油菜菌核病对菌核净的抗性菌株。为了掌握西南地区油菜菌核病菌对多菌灵和菌核净的抗药性动态,对四川省、贵州省、重庆市的主要油菜种植地进行了多菌灵和菌核净的抗药性监测以及抗性机理的初步研究。采用菌丝生长速率法测定了104株油菜菌核病菌菌株对多菌灵的敏感性,EC50值变化范围为0.00912～0.1827μg/mL,最不敏感菌株的EC50值是最敏感菌株的20倍,平均EC50值为0.06705±0.03423 μg/mL。104株油菜菌核病菌对多菌灵的敏感性频率分布呈连续单峰曲线,接近正态分布,没有出现敏感性下降的抗性群体,这些菌株均为多菌灵敏感菌株,因此可以采用这些菌株的平均EC50值作为西南地区油菜菌核病菌对多菌灵的敏感性基线。以5μg/ml作为鉴别剂量,对2013-2014年从四川省、贵州省、重庆市的共16个区县采集得到的1292株油菜菌核病菌进行多菌灵田间抗性监测,结果显示,西南地区的油菜菌核病菌对多菌灵仍然以敏感菌株为主,仅监测到3株多菌灵田间抗性菌株,抗性频率为0.23%,3株多菌灵田间抗性菌株的EC50值分别为140.25μg/mL、254.48μg/mL以及大于1000μg/mL,抗性倍数分别为2091倍、3795以及大于10000倍,均为高抗菌株。以引物B1-1/B3-1PCR扩增3个抗性菌株的β-微管蛋白基因片段,与标准菌株1980的β-微管蛋白基因进行比对,发现多菌灵抗性菌株β-微管蛋白基因在第593位碱基A变成C,相应的其198位氨基酸由谷氨酸变成丙氨酸。采用菌丝生长速率法测定了106株油菜菌核病菌菌株对菌核净的敏感性,EC50值变化范围为0.0161-1.0077μg/mL,最不敏感菌株的EC50值是最敏感菌株的62倍,平均EC50值为0.3209±0.1912μg/mL。106株油菜菌核病菌对菌核净的敏感性频率分布呈连续单峰曲线,接近正态分布,没有出现敏感性下降的抗性群体,这些病菌均为菌核净敏感菌株,因此可以采用这些菌株的ECso值作为油菜菌核病菌对菌核净的敏感基线：以5μg/ml作为鉴别剂量,对2013-2014年从四川省、贵州省、重庆市的共16个区县采集得到的1292株油菜菌核病菌进行菌核净田间抗性监测。结果表明,西南地区的油菜菌核病菌对菌核净仍然以敏感菌株为主,仅监测到2株菌核净田间抗性菌株,抗性频率为0.15%。2株菌核净抗性菌株ECso分别为131.1μg/mL、27.65μg/mL,抗性倍数分别为408倍和86倍,为高抗菌株和中抗菌株。为了进一步了解油菜菌核病菌对菌核净的抗性机理,通过药剂驯化得到室内菌核净抗性突变菌株。将田间抗性和室内抗性菌株在不含药的PDA培养基上面进行连续转代培养,发现菌株对菌核净的抗性水平没有显著性的降低,说明菌株对菌核净的抗性是可以比较稳定的遗传；测定田间及室内抗性菌株与敏感菌株的生活力,结果表明：菌核净抗性菌株产生菌核数量以及菌丝生长速度明显低于敏感菌株,但单个菌核重量比野生菌株大；致病性测定结果表明,对菌核净不同抗性的油菜菌核病菌对离体油菜叶片的致病力存在差异,敏感菌株致病能力最强,田间抗性菌株次之,室内抗性菌株最差；比较抗性、敏感性菌株在含有不同浓度的NaCl或者葡萄糖的PDA培养基上的生长速率,结果表明,菌核净抗性菌株对外界环境的渗透压更敏感；交互抗性测定结果表明,菌核净抗性菌株对啶酰菌胺、戊唑醇、乙霉威以及嘧菌酯不存在交互抗性,但是对腐霉利和咯菌腈存在正交互抗性。根据已报道的油菜菌核病菌双组分组氨酸激酶编码序列Shkl （SS1G12694）设计引物AA1F/AA1R扩增抗性菌株的双组分组氨酸激酶编码基因部分片段,测序比对分析,发现不同室内抗性菌株的Shkl基因的不同位点发生了不同的突变：菌株XN29R的637位碱基由C变为G,相应的213位氨基酸由丙氨酸变为甘氨酸,另外1049位碱基由G变为T,1051位碱基由T变为G,相应的311位氨基酸由天冬氨酸变为终止密码子；菌株XN31R的1049位碱基由G变为T,1051位碱基由T变为G,相应的311位氨基酸由天冬氨酸变为终止密码子；菌株XN43R的1034位碱基由C变为T,1035位碱基由C变为A,相应的305位氨基酸由苏氨酸变为异亮氨酸。然而对田间抗性菌株Shkl基因的检测结果却不同,田间高抗菌株JR1-1中没能扩增出Shkl基因部分片段片段,而中抗菌株JRl-2在Shkl基因部分基因片段中未没有发现碱基突变。以上研究结果表明,Shk1基因上碱基突变导致对应氨基酸变化可能是油菜菌核病菌菌核净室内诱导抗性菌株产生的原因,而田间抗性菌株的抗性机理还不清楚。通过本实验,充分了解了西南地区油菜菌核病菌对多菌灵和菌核净的抗性现状,同时进一步了解了油菜菌核病菌对菌核净的抗性机理,为今后的油菜菌核病的化学防治提供更加充分的理论基础。