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第一章神经干细胞的分离、培养及蛋白表达第一节神经干细胞的分离、培养及鉴定研究背景神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是指中枢神经系统中具有自我更新能力并且能够分化成脑细胞(包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞)的多潜能细胞。目前已经相继从啮齿类动物和人的胚胎及成年脑组织中系统分离、纯化出神经干细胞。神经干细胞不仅能促进神经元的再生和脑组织的修复,而且通过基因修饰还可用于神经系统疾病的基因治疗,表达外源性的神经递质、神经营养因子及代谢性酶,为许多难以治疗的神经系统疾病提供了新的治疗途径。虽然这类细胞终身存在,但由于绝对数量和局部微环境的限制,使损伤神经组织自我修复作用微乎其微。采用外源性的神经干细胞移植己被认为是治疗神经系统疾病最具前景的治疗方法之一。方法本研究采用无血清培养液,给予能刺激神经干细胞增殖的生长因子—bFGF和EGF,利用神经干细胞具有自我更新和增殖能力的特性,从胚胎大鼠的大脑皮层、室管膜下区和海马等部位分离培养神经干细胞。结果成功从新生大鼠脑组织中分离、培养出神经干细胞,并能够诱导分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞。经3次、10次、20次传代后的细胞同原代细胞一样,分化形成的细胞中均可检测到三种不同类型的成熟神经细胞。结论神经干细胞是能自我更新并具多种潜能的母系神经细胞,它能分化成各种神经组织细胞表型,如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。神经干细胞的成功分离和体外培养对通过细胞移植治疗中枢神经系统疾病的研究具有重要意义。第二节PPARγ、P21WAF1/CIP1及P16在神经干细胞的表达研究背景过氧化物酶增殖物激活受体(Peroxisome proliferators-activatedreceptor,PPAR)是核激素受体超家族的成员,有3种亚型:PPARα、PPARγ和PPARβ/δ。它们由不同的基因编码,却有相似的氨基酸序列,尤其是DNA结合结构域和配体结合结构域的氨基酸序列。PPARγ是一类由配体激活的核转录因子,属Ⅱ型核受体超家族成员。PPARγ及其相关通路在胰岛素的敏感性,组织的稳态平衡及细胞功能的调节中都发挥着重要作用。P21基因又称CIP1(cyclin dependent kinase interacting proteinⅠ),WAF1(wild-type p53-activated fragment 1)或SDI1(senescentcell-derived inhibitor 1)基因,为P53的下游基因,是细胞周期重要调控因子—细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin dependent kinaseinhibitors,CKIs)中的一员。P21WAY1/CIP1基因是细胞周期的有效调控者,与细胞衰老也有关系,同时还是抑制肿瘤细胞生长的关键因子。P16基因是编码人类细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)抑制因子的基因,又称多肿瘤抑制基因(MTS1)、CDKN2。正常情况下P16蛋白水平在G1晚期达高峰,这可能与Rb蛋白功能状态有关。P16蛋白调节细胞周期的可能途径是:在G1晚期,细胞周期蛋白D1水平升高,进而结合CDK4和/或CDK6并使其活化,促使Rb蛋白磷酸化,转录活化因子E2F与Rb蛋白分离,刺激细胞增殖。同P21WAF1/CIP1一样,P16也是一种CKI,负性调节细胞周期。方法采用细胞免疫荧光标记法、western blot和RT-PCR分别检测PPARγ、P21WAF1/CIP1和P16蛋白或mRNA在神经干细胞不同阶段的表达水平。结果1.免疫荧光定位显示,PPARγ、P21WAF1/CIP1或P16蛋白被染成绿色,在神经干细胞上均可见。荧光主要位于细胞核内,细胞质中也有少许,说明它们均主要在细胞核内表达。2.Western blot示,经PPARγ、P21WAF1/CIP1或P16抗体分别孵育后出现的强阳性蛋白印迹条带也证实了PPARγ、P21WAF1/CIP1或P16在神经干细胞上的表达。并且随诱导分化时间延长,PPARγ表达量逐渐降低,蛋白条带变浅;而P21WAF1/CIP1及P16表达量逐渐升高,蛋白条带加深。3.RT-PCR示,在未分化及已分化的神经干细胞中均检测到PPARγ、P21WAF1/CIP1及P16的cDNA。同western blot结果的趋势一致,PPARγ从分化后第一天即开始显著减少;而P21WAF1/CIP1和P16 mRNA在神经干细胞分化的过程中逐渐升高,在P21WAF1/CIP1尤其明显。结论随着神经干细胞的分化,PPARγ的mRNA和蛋白表达水平逐渐下降,而P21WAF1/CIP1和P16则逐渐上升。提示PPARγ、P21WAF1/CIP1和P16可能均参与了神经干细胞增殖及分化的调节,表现为PPARγ促进神经干细胞的自我更新,减少神经干细胞中继续分化细胞的比例;而P21WAF1/CIP1和P16在一定程度上抑制神经干细胞的增殖,促进其进一步分化。第二章神经胶质瘤与P21WAF1/CIP1、P16蛋白表达的相关性分析研究背景神经胶质瘤包括了原发性脑肿瘤中的最常见类型,并且绝大部分都是星型胶质细胞瘤和少突胶质细胞瘤。近10年来,恶性神经胶质瘤的治疗虽然取得了相当的进展,但是外科治疗作为其基本治疗方法,很难既能有效切除不局限于肉眼所见范围的肿瘤,又不损伤神经功能。这就导致神经胶质瘤的预后很差。人们进行了多项研究来解决这一难题,并在近期揭示了脑肿瘤中可引起细胞周期失调的一系列分子活动。而关注较多的抑癌基因突变并灭活也是多种肿瘤的一个常见特征。但关于抑癌蛋白在细胞生长失调及恶性肿瘤进程中所发挥作用的分子机制,仍不是十分清楚。P21WAF1/CIP1和P16蛋白是两个已知重要的抑癌蛋白。分析P21WAF1/CIP1和P16蛋白在神经胶质瘤的表达有助于预测神经胶质瘤的生物学习性,从而确定肿瘤对治疗的依从情况。因此,本研究的目的即探讨P21WAF1/CIP1,P16蛋白在神经胶质瘤上的表达水平及其与神经胶质瘤分级的关系。方法采用细胞免疫荧光标记法、western blot和RT-PCR分别检测P21WAF1/CIP1和P16蛋白在神经胶质瘤细胞系和正常星形胶质细胞系,神经胶质瘤和正常脑组织上的表达,并讨论它们的表达水平与神经胶质瘤分级之间的相关性。结果1.P21WAF1/CIP1和P16在人神经胶质瘤细胞系(T98G)上的表达:正常的人星形胶质细胞(HA)阳性反应强烈,细胞核内可见弥漫的棕黄色反应物;而在神经胶质瘤细胞系(T98G)内,因P21WAF1/CIP1和P16的表达较低,阳性细胞数量明显少于正常星形胶质细胞组。2.P21WAF1/CIP1和P16在人神经胶质瘤组织上的表达:与Ⅰ～Ⅱ级相比,Ⅲ-Ⅳ级神经胶质瘤中P21WAF1/CIP1和P16表达阳性的发生率偏少(p=0.005)。而且随着肿瘤级别的升高,神经胶质瘤组织中P21WAF1/CIP1和P16表达进一步降低。3.半定量RT-PCR法检测人神经胶质瘤和正常脑组织中P21WAF1/CIP1和P1基因的表达水平:正常脑组织中P21WAF1/CIP1和P16基因的表达水平都明显高于人神经胶质瘤组织。正常脑组织中两者条带的强度分别超过Ⅰ级人神经胶质瘤组织的1.28倍(P21WAF1/CIP1)和1.07倍(P16),并且随着肿瘤级别的升高,这一比值更加显著升高。结论P21WAF1/CIP1和P16的表达水平和神经胶质瘤临床分级成显著负相关,并且P21WAF1/CIP1和P16在肿瘤组织中可协同表达。P21WAF1/CIP1和P16可能不仅参与了神经胶质瘤的发生,也参与了肿瘤的进展。