论文部分内容阅读
胆固醇是脊椎动物中主要的固醇形式。胆固醇的代谢异常与许多重要疾病，如动脉粥样硬化、阿尔海默氏症、胆结石等密切相关。在哺乳动物细胞中，胆固醇的动态运输与其功能发挥密切相关。NPC家族蛋白是参与胞内胆固醇运输的一类重要蛋白质，包括Niemann-Pick C1 Like1(NPC1L1)和Niemann-Pick C1(NPC1)两个蛋白。其中，NPC1L1是参与饮食和胆汁中胆固醇吸收的关键蛋白质，介导胆固醇从细胞质膜运输到胞内；NPC1是NPC1L1的同源蛋白，它主要参与低密度脂蛋白(LDL)来源的胆固醇在细胞内的运输。NPC1突变会导致胆固醇在溶酶体内的堆积，引起神经细胞退行性死亡，称为NPC疾病。本论文工作重点研究NPC家族中NPC1 L1和NPC1介导胆固醇运输的分子机制。 实验室前期研究发现NPC1L1蛋白通过与脂质筏蛋白Flotillins形成富含胆固醇的NPC1L1-Flotillin-Cholesteroi膜微结构域，进一步募集C1athrin/AP-2蛋白复合物，介导NPC1 L1蛋白的内吞和胆固醇的吸收。但是，NPC1L1蛋白感受胆固醇水平的分子机制尚不清楚。在本研究工作中，发现NPC1L1蛋白的NH2-端结构域(NTD)能够特异性结合胆固醇，其中L216等氨基酸突变后影响该蛋白质与胆固醇的结合，进而在细胞及小鼠模型上影响胆固醇的吸收，而NPC1L1蛋白NTD结合胆固醇的能力决定了NPC1L1-Flotiilin--Cholesterol膜微结构域的形成。有趣的是，NPC1L1蛋白NTD并不结合植物甾醇。这些结果揭示了哺乳动物中肠道特异性吸收胆固醇的分子机制。此外，25-羟胆固醇能够竞争性抑制NPC1L1蛋白对胆固醇的吸收，提示NPC1 L1蛋白NTD可以作为筛选新型胆固醇吸收抑制剂的靶点。 本论文工作还进一步探索了NPC1蛋白介导胆固醇运输的分子机制。位于晚期内吞体和溶酶体上的NPC1能促进LDL来源的胆固醇转运到细胞质膜、高尔基体等细胞结构中，但参与这个过程的其他关键蛋白质因子尚不清楚。一方面，通过寻找NPC1的相互作用蛋白质，发现DENND3蛋白及其作用靶点Rab12蛋白与NPC1存在相互作用，并且Rab12与NPC1在细胞内可以共定位；通过RNA干扰实验发现DENND3或Rab12沉默后会引起细胞内胆固醇的堆积，说明DENND3蛋白可能通过调控Rab12蛋白参与了NPC1蛋白介导胆固醇运输的过程。另一方面，对NPC1蛋白所有细胞质面的氨基酸进行Ala-Scanning筛选，发现E1165等氨基酸位点突变后会影响NPC1蛋白介导的胆固醇运输。 综上所述，本论文工作发现NPC1L1蛋白NTD结合胆固醇的能力，与富含胆固醇的NPC1L1-Flotillin-Cholesterol膜微结构域的形成和胆固醇的特异性吸收有关，并且NPC1L1可以作为靶点发展新的胆固醇吸收抑制剂，从而揭示了NPC1L1蛋白感受胆固醇吸收的分子机制及特异性介导胆固醇吸收的分子基础；同时论文工作还探索了NPC1蛋白介导胆固醇转运的分子基础。