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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是一种引起母猪繁殖障碍及新生仔猪呼吸道症状和高死亡率的新病毒病。该病自1987年首次在美国发现以来,各国相继发生流行性感染,给世界养猪业造成了严重经济损失,因此国际兽疫局(OIE)将其列为B类传染病,我国将其列为二类传染病。PRRS病毒的流行病学特点是此病一旦在猪群中出现就很快通过空气和接触及人工授精等途径传播开来。PRRS自1995年在我国大陆发现后传播迅速,至今已遍布全国各地。由于PRRS没有特效治疗药物,免疫接种仍然是预防和控制该病的主要措施。但现有的商品化疫苗(弱毒苗和灭活苗)均存在一定程度的缺陷,其中弱毒苗虽然免疫效果较好,但存在散毒和返强的危险性;灭活苗与弱毒苗相比,虽然安全性较好,但保护力不强,需要反复多次免疫接种,效果不稳定,还经常导致免疫失败。可以说缺少安全、有效的疫苗是目前预防和控制猪繁殖与呼吸综合征发生与流行甚至大爆发的主要原因。因此须研制安全有效的疫苗是控制该病流行主要因素。本研究根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组GP5、M蛋白基因序列,设计合成了两对特异性引物,对PRRSV吉林株GP5、M两种主要结构蛋白基因进行了RT-PCR扩增,将目的基因片段克隆到pMD-18T载体,构建出重组阳性质粒pMD18T-G、pMD18T-M,对阳性质粒进行测序及基因遗传进化分析。测序结果表明,PRRSV吉林株GP5蛋白基因全长603bp、编码200个氨基酸,M蛋白基因全长525bp、编码174个氨基酸;对GP5蛋白基因和M蛋白基因的遗传进化分析表明,PRRSV吉林株GP5蛋白基因与01NP1.2毒株BJ-4毒株、RV-2332等标准的PRRSV强毒株聚为一枝,同属于PRRSV美洲基因型,且与该基因型中01NP1.2和BJ-4等毒株有很高的同源性,而与欧洲基因型LV毒株同源性很低;PRRSV吉林株M蛋白基因遗传进化分析结果与GP5蛋白基因结果一致。上述分析结果说明PRRSV吉林株的基因型为美洲型,与国内分离株BJ-4株的同源性极高。另外,用DNAstar软件对PRRSV吉林株与BJ-4毒珠和RV-2332代表毒珠GP5蛋白和M蛋白抗原表位分析表明,3种毒株抗原表位基本一致,说明PRRSV吉林株具有国内外其它强毒株相似的抗原特性,为核酸疫苗和重组腺病毒疫苗的研究奠定基础。以pIRES-neo为载体、PRRSVGP5、M蛋白基因为目标基因,构建了两种真核表达质粒pIRES-GP5和pIRES-M并对昆明小鼠进行了免疫接种试验,免疫共分pIRES-neo、pIRES-GP5、pIRES-M、pIRES-G+pIRES-M和灭活苗5个试验组,分别于免疫前、首免后1周、2周、二免后1周、2周、3周以及三免后2周、5周断尾采血,分离血清,用间接ELISA和血清中和试验检测免疫小鼠血清的抗体应答水平,以淋巴细胞转化试验检测免疫小鼠的细胞免疫水平。结果表明,各免疫组均可诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫应答,其中pIRES-GP5和pIRES-M两基因混合免疫组免疫应答好于其它免疫组,但均低于PRRSV灭活苗免疫组。以感染性犬2型腺病毒全基因组为载体,构建了能表达PRRSV GP5、M蛋白的重组质粒pPoly-Ⅱ-CAV-2-GP5和pPoly-Ⅱ-CAV-2-M。用PmeI+AscI双酶切重组犬2型腺病毒质粒pPoly-Ⅱ-CAV-2-GP5和pPoly-Ⅱ-CAV-2-M,释放重组基因组,采用脂质体介导法,将重组病毒基因组DNA导入到MDCK细胞中,重组病毒在MDCK细胞上产生了典型的腺病毒细胞病变。提取病毒基因组,经多种酶切和PCR鉴定正确,表明转染获得了含目的基因的重组病毒CAV-2-GP5和CAV-2-M毒株;对重组病毒CAV-2-GP5和CAV-2-M毒株经该RT-PCR检测表明,两株重组病毒均能转录出相应的GP5、M蛋白基因mRNA;经Western-blot实验证实重组病毒能表达相应的GP5、M蛋白。体外连续30代传代试验表明,重组病毒CAV-2-GP5和CAV-2-M具有良好的遗传稳定性。以上试验表明,首次获得了能够表达目的蛋白的重组犬2型腺病毒CAV-2-GP5和CAV-2-M二毒株。重组腺病毒CAV-2-GP5和CAV-2-M采用肌肉注射免疫仔猪试验,结果显示,两株重组病毒均能刺激机体产生针对各自携带外源抗原的特异性抗体,同时,重组腺病毒CAV-2-GP5和CAV-2-M单独免疫和混合免疫均可诱导产生特异性体液免疫和细胞免疫;但混合免疫能更有效诱导机体产生较高水平的体液和细胞免疫应答。