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本实验室分离得到一株产锰过氧化物酶的白腐真菌-裂褶菌F17(Schizophyllum sp.F17)。前期的研究表明,该菌对偶氮、蒽醌、三苯甲烷和杂环等不同结构类型的多种合成染料显示出较强的脱色能力。本实验中以松木屑为培养基,裂褶菌F17经过固态发酵,产生以锰过氧化物酶为主的胞外酶。具体研究内容与结果如下:(1)实验通过超滤浓缩、DEAE-纤维素DE52离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析等步骤,分离纯化得到电泳纯的锰过氧化物酶。最终锰过氧化物酶的比活力为9.2,活力回收率为3.8%。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,锰过氧化物酶的相对分子量为48.7 kDa。锰过氧化物酶的等电点为3.60。使用苯酚-硫酸法测得该酶的含糖量为18%。使用Edman降解方法,测得锰过氧化物酶的N-末端氨基酸序列为VTCPDGVNTATNAAA。以DMP作为底物,测得锰过氧化物酶的最适反应pH和最适反应温度分别为pH 6.8和35℃。25℃时,锰过氧化物酶在pH 4-7的缓冲溶液中保温1 h活力十分稳定。锰过氧化物酶在25℃,pH 4.5下,以Mn2+,H2O2,愈创木酚,ABTS和DMP为底物的Km值分别为35.2,6.7,13.1,47.8和122.9μmol/L。检测了多种化学物质对锰过氧化物酶的活力的影响。重金属中,Co2+,Pb2+,Ba2+,Zn2+和Cu2+在所试浓度范围内对锰过氧化物酶的活力无明显影响,Ag+在所试浓度范围内强烈抑制锰过氧化物酶的活力,Fe2+和Fe3+高浓度时强烈抑制锰过氧化物酶的活力。其他金属离子中,Na+高浓度时对锰过氧化物酶的活力有所抑制,K+,Al3+和Mg2+在所试浓度范围内对锰过氧化物酶的活力无影响,Ca2+和Mn2+高浓度时能够促进锰过氧化物酶的活力。抑制剂中,DTT和亚铁氰化钾在所试浓度范围内均完全抑制锰过氧化物酶的活力,EDTA和NaN3高浓度时对锰过氧化物酶的活力高度抑制,硫脲在所试浓度范围内对锰过氧化物酶的活力微弱抑制。纯化的锰过氧化物酶能够有效地对3种偶氮染料刚果红、金橙G和橙黄Ⅳ进行脱色,测得的初始脱色率分别为7.74,1.61和1.38 mgL-1 min-1。(2)实验分别采用海藻酸钠、明胶和壳聚糖作为载体,并以戊二醛为交联剂,通过包埋-交联和吸附-交联2种耦合固定化方法制备固定化锰过氧化物酶。探讨了锰过氧化物酶的不同固定化条件和固定化酶的部分性能。锰过氧化物酶的3种耦合固定化方法的适宜条件分别为:海藻酸钠包埋-交联固定化中,海藻酸钠的浓度为1%,戊二醛的浓度为3%,CaCl2的浓度为0.1 mol/L;明胶吸附-交联固定化中,明胶微粒与酶液的比值为1g/1 mL,戊二醛的浓度为0.2%,交联时间为10 min;壳聚糖吸附-交联固定化中,使用浓度为3%的壳聚糖制作微球,戊二醛的浓度为0.2%,壳聚糖微球与酶液的比值为1.4g/1 mL,交联时间为70 min。3种锰过氧化物酶的耦合固定化,活力回收率分别达到了70%、67%和64%。与游离酶相比,制备的3种固定化酶最适反应pH分别由7.0降低到5.0、5.0和3.0,最适反应温度分别由35℃升高到75℃、55℃和75℃。3种固定化锰过氧化物酶的耐热性都显著提高,其中用壳聚糖制成的固定化酶在pH 2.2-11的宽范围内表现出很好的酸碱耐受性。30℃连续测定6-9次酶活力,重复使用的3种固定化酶显示出良好的稳定性。将固定化酶应用在偶氮染料的脱色中,用明胶制成的固定化酶在静置和摇床条件下,以及用海藻酸钠制成的固定化酶在摇床条件下,均表现出与游离酶相近的脱色能力,并且在重复进行的摇床实验中,脱色能力未降低,反应前后的酶活力均没有损失。