肌腱是肌肉两端索状的致密结缔组织,分别附着在两块或两块以上不同的骨上便于肌肉附着和固定,其功能是从肌肉传递力至骨、支持身体移动。由于急性创伤或慢性损伤导致的肌腱损伤是常见疾病,常伴随疼痛及躯体发病从而影响生活。由于肌腱缺乏血管和细胞,所以受伤的肌腱自愈能力极为有限。目前,临床选择治疗肌腱损伤大多为自体移植和异体移植。自体移植会对患者造成二次创伤,而同种异体移植又会有传染病原体及免疫排斥的风险。近年来,组织工程技术显示了对肌腱再生和修复的强大潜力。大量的研究方法使用了多种类型的细胞,支架材料对肌腱进行再生和修复,但直到现在还没有得到临床切实可行的办法。腱细胞(Tenocytes)是肌腱的固有细胞,具有其他种子细胞无法比拟的优势,但是,获得腱细胞会对患者造成二次伤害,而且取得的细胞数量少,体外培养腱细胞短期内就会丢失其表型。真皮成纤维细胞(Dermal fibroblast)可以通过皮肤活检获得而且适合于体外培养,真皮成纤维细胞能够与多数生物材料粘附并增殖,合成丰富的细胞外基质,但真皮成纤维细胞在腱修复的过程中易形成瘢痕,影响肌腱的力学功能,而且受限于患者的年龄。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow-derived Stem Cells)可以通过微创获得,体外培养有较强的增殖能力,拥有骨,软骨,脂肪和肌腱分化的潜力。以往的研究结果显示,MSCs可以形成肌腱样组织并改进受伤肌腱的机械性能。但长期体内移植表明,修复的肌腱组织经常发生骨化、损害了肌腱的结构并影响功能。胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell)因具有全能性及无限增殖能力而备受学者青睐。欧阳宏伟等建立了胚胎干细胞在体外分化为肌腱细胞、并用于腱再生的方法,其结果表明,胚胎干细胞来源的肌腱细胞通过表达肌腱特异性蛋白,分泌生长因子从而促进腱再生,同时无任何畸胎瘤和骨化发生。然而,使用胚胎干细胞涉及胚胎的破坏,所以一直受到伦理道德的限制。孤雌干细胞(parthenogenetic Embryonic Stem Cells)可通过孤雌囊胚的内细胞团获得,在许多方面具有与ESCs相似的特性。pSCs来源于化学或物理方法激活的卵母细胞,没有破坏受精卵,从而避免了伦理道德方面的限制。在灵长类动物中,孤雌囊胚不能发育为胎儿(遗传缺陷影响胎盘形成),而且HLA单倍型使pSC有较好的组织相容性,可以减少移植后免疫排斥的风险,相比较ESCs具有更大的优越性。pSCs可以分化为视网膜色素上皮样细胞、肌肉样和骨样细胞、神经细胞和肝细胞。据报道pSCs分化的心肌细胞可以明显改善受损的心肌,更重要的是,pSCs来源的心肌细胞在异体移植中表现出免疫耐受,赋予了pSCs广阔的应用前景。实验方法目前已可以将ESCs向肌腱细胞定向诱导,然而迄今为止没有研究利用pSCs向肌腱细胞定向诱导分化。因此本研究以pSCs作为种子细胞,通过拟胚体(EBs)的自主分化、刮取纤维样细胞、接种并扩增；通过流式细胞术、免疫细胞化学鉴定其表型为间充质干细胞(pMSCs),通过体外成骨、成软骨及成脂能力进一步验证。将pMSCs接种于Flexcell弹力板进行力学加载,诱导pMSCs分化为肌腱细胞；将pMSCsi(pMSCs加载力学刺激后)接种于PLGA三维支架材料,进行异位移植,在体内成功构建了肌腱样组织。新生组织具有天然肌腱的结构特征,表达胶原合成相关因子、肌腱修复相关因子和肌腱细胞表型标志。1.pSCs的体外培养特征及全能性鉴定将C57BL/6小鼠pSCs及129S4/SvJae小鼠ESCs (J1)体外培养并进行全能性鉴定,包括碱性磷酸酶染色,全能性表面抗原SSEA-1和全能性转录因子Oct4、Nanog免疫细胞化学染色,WST-1实验检测细胞增殖活性,实时定量PCR检测与细胞周期相关的印记基因；克隆形成实验鉴定细胞形成克隆的能力,实时定量PCR检测与细胞粘附,迁移相关基因,为其向肌腱细胞定向诱导分化提供理论和实验基础。2. pSCs形成EBs及特征将pSCs接种于低粘附性96孔培养板形成EBs,计算EBs形成的效率。将5天后形成的EBs包埋于石蜡,行H&E及TUNEL染色,观察EB的大体及凋亡特征。3.体内体外分化全能性鉴定EBs形成5天后,将EBs接种于铺有明胶的培养板中,继续培养7天、14天、21天、28天,倒置显微镜下观察细胞形态学变化,实时定量PCR检测内,中,外胚层相关基因表达。实时定量PCR和免疫细胞化学染色检测pSCs与ESCs自主分化中上皮-间充质转化标志基因。免疫组织化学染色确定EBs分化时,中胚层基因是否表达。皮下注射pSCs和ESCs观察体内畸胎瘤形成。4.获得pSCs来源的间充质干细胞(pMSCs)据上述实时定量PCR结果,在EBs接种于铺有明胶的培养板中7天后,使用细胞刮刮取纤维状细胞团块,自然沉降后接种至新的培养板,体外扩增。流式细胞术及免疫细胞化学检测所得到的细胞系。5.pMSCs向骨,软骨,脂肪诱导分化使用成骨、成软骨及成脂诱导液,将上述得到的细胞向骨、软骨及脂肪细胞定向分化。对pMSCs进行诱导后,在不同的时间点通过细胞形态学观察和实时定量PCR检测骨、软骨及脂肪细胞标志性基因、茜素红、Von Kossa、番红O、油红O染色和免疫组织化学染色对诱导后的细胞进行鉴定。6.机械拉伸诱导pMSCs向肌腱细胞方向分化对pMSCs实施不同时间的机械拉力(频率：0.1Hz;应变力大小：10%形变；拉伸时间：24小时和10天),通过实时定量PCR、Western-blot及免疫组织化学检测肌腱细胞标志基因的变化。C57/BL6小鼠骨髓MSCs和fibroblast作为对照组。7.拉力诱导后的细胞与PLGA的生物可容性将拉力刺激10天后的pMSCs接种三维支架材料PLGA上,通过DNA提取、激光共聚焦显微镜、扫描电镜和透射电镜观察细胞在三维支架上的生长和细胞外基质分泌情况。8.体内生成组织工程肌腱将上述支架-细胞(CM-Dil标记)复合物接种于裸鼠皮下,分别在6周和12周后取出,通过大体观察、组织学染色、免疫组织化学染色、特殊染色及激光共聚焦显微镜、扫描电镜和透射电镜检测新生组织。实验结果通过上述实验方法,我们获得了如下实验结果：1.pSCs具有全能性、克隆形成及增殖能力,随体外传代次数增加全能性保持不变。pSCs碱性磷酸酶染色阳性,SSEA-1、Nonog和OCT4表达强阳性。体外培养时,细胞具有克隆形成的能力,不过较ESCs少。当接种密度为100和250/孔时,pSCs及ESCs形成的克隆分别为14.00 ± 3.08 vs.20.44 ± 4.95 (p= 0.004),38.22 ± 4.43 vs.44.22 ± 4.32 (p= 0.01)。pSCs形成点状克隆,为典型的"holocolony",而ESCs形成点状或环状克隆,随细胞接种密度增加,此现象愈加明显。与pSCs相比,ESCs显著高表达vtn但itgbl表达并无差异。免疫细胞化学结果显示ESCs表达Itgbl及Vtn强烈且均匀的分布的分布于整个细胞克隆。而pSCs中,Itgbl及Vtn只是零星的分布于细胞表面。WST-1实验证明细胞具有增殖能力,但也较ESCs低。igf2r和p57kiP2表达并无差异,igf2在J1细胞明显高表达(3.26±0.4 vs.1.09±0.21,p<0.001).2.pSCs体外悬浮培养均可以有效地形成EBs,但形成EBs的能力比ESCs低(21.7%±3.4%vs.35.3%±5.2%)。TUNEL实验结果显示,EBs形成的过程中ESCs凋亡细胞比率较低(8.79%±2.21%vs.9.28%±3.8%),但差异无显著性。3.将上述EBs接种至包被有明胶的培养板,不同时间点收取样品总RNA。实时定量PCR结果显示伴随EBs自主分化,pSCs和ESCs均具有向内、中、外三胚层分化的能力,经历上皮-间充质转化,免疫细胞化学结果证明两种细胞均具有向中胚层分化的能力。EBs接种至铺有明胶的培养板,迁移出的细胞具有多种形态,分别有上皮状、纤维状及心肌细胞。畸胎瘤实验证明pSCs在体内也具有向内、中、外三胚层分化的能力,形成成熟的骨、软骨、肌肉、淋巴管、粘液上皮及神经节。4.使用细胞刮刮取纤维状细胞团块,接种后可以体外扩增,可获得形态较一致纤维状细胞(pMSCs)。流式细胞术检测结果证明pMSCs表达CD29、CD13、CD44、CD73、 CD90.2和CD105。免疫细胞化学证实pMSCs表达中胚层标志物Vimentin, Myog, Myosin heavy chain和α-Actin。与eMSCs的特征基本一致。5.获得的间充质干细胞(pMSCs及eMSCs)均具有向骨,软骨,脂肪分化的能力。实时定量PCR结果显示成骨标志基因alp, ibsp, bglapl, opn和runx2表达明显上调。茜素红和Von Kossa染色阳性,证明pMSCs及eMSCs均具有成骨能力。实时定量PCR显示col2al及aggrecan在pMSCs及eMSCs诱导21天后均出现明显地上调,番红O及免疫细胞化学染色显示COL2al及Aggrecan阳性,证明pMSCs及eMSCs均具有成软骨能力。实时定量PCR显示fabp4及c/ebp在pMSCs及eMSCs诱导28天后均出现明显地上调,油红O染色阳性,表明pMSCs及eMSCs具有成脂肪能力。6.机械拉伸可以诱导pMSCs向肌腱细胞方向分化。细胞持续加载应力24小时或者间隔加力10天(16h/d)均可以使肌腱特异性基因(tnc、collal、col3al、tnmd、eya2、ephap4)表达上调。col1a1:3a1胶原比率上升。加载力学刺激后,细胞排列具有方向性,免疫细胞化学显示Col1a1、Col3a1、Col5a1、Hsp47、TNMD、EYA2、TNC、Bmp2及Bmp13均阳性表达。7.激光共聚焦显微镜和扫描电镜观察结果显示,PLGA与应力加载后的细胞具有良好的组织相容性。细胞在3D支架可以增殖及分泌细胞外基质。8.异位移植后取出细胞-材料复合物,样本表面光滑,呈半透明状。组织学染色结果表明新生组织细胞排列整齐,且延长轴分布,大体观察显示6周及12周组织Collal, Col3a1, Col5a1, Hsp47, TNMD, EYA2, TNC, Bmp2及Bmp13均阳性表达。移植12周后,新生组织胶原纤维沿长轴密集排列且呈典型的波浪状。激光共聚焦显微镜观察CM-Dil标记阳性,表明新生组织由移植后的细胞构成。结论孤雌胚胎干细胞可以分化为MSC,经定向诱导分化后可分化为肌腱样细胞,用于组织工程肌腱再造。创新点：1,对小鼠pSCs体外悬浮培养是否形成拟胚体、形成拟胚体的效率进行研究,有助于研究pSCs的后续分化。TUNEL染色证实小鼠pSCs在缺少父系基因印记时,也可以发生凋亡。2,通过拟胚体自主分化,证明pSCs与ESCs均表现出上皮-间充质转化。3,通过拟胚体自主分化,得到较纯的小鼠pSCs来源的间充质细胞。4,将pSCs来源的间充质细胞诱导分化为肌腱样细胞,并用于体内肌腱样组织再生。