论文部分内容阅读
钙离子是植物逆境胁迫中重要的第二信使。环境胁迫中产生的各种钙信号，能被植物细胞中特定的钙离子感受器识别和解码，并通过与互作蛋白的相互作用转导钙信号，进而产生一系列特定的生理生化反应。类钙调磷酸酶B亚基蛋白（简称CBL）是植物特有的一类钙传感蛋白。自CBL-CIPK信号系统被发现以来，CIPK一直被认为是CBL的唯一靶蛋白分子，两者相互作用参与一系列环境改变引起的钙离子信号途径。但近期的文献报道，拟南芥CBL3也能与5-甲基硫腺苷核酸酶（甲硫氨酸循环中的关键酶）AtMTN1互作，参与调控植物生长发育过程中乙烯和植物多胺的生物合成途径。 本研究利用已获得的过表达OsMTN基因及OsCBL3基因的T3代株系以及T-DNA插入突变的OsCBL3株系，研究了转基因幼苗对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性。半定量RT-PCR结果表明，部分的转基因株系中OsMTN或OsCBL3蛋白的表达量明显的增加了，而T-DNA插入突变的OsCBL3株系中OsCBL3的表达量却显著性降低了。此外，耐逆境胁迫实验结果显示，部分过表达的OsMTN株系以及过表达OsCBL3株系耐盐性有所降低，地上部分的耐旱性也有所降低，而地下部分的耐旱性则没有显著性变化;T-DNA插入突变的OsCBL3株系耐盐性明显降低，地上部分耐旱性也有所降低，而地下部分的耐旱性则没有明显的变化。 本研究再次利用BiFC技术进行实验，进一步研究蛋白互作发生的亚细胞位点。结果表明OsMTN与OsCBL2、3、6在质膜和液泡膜上均有互作，原生质体图更直观的展现了这一点。亚细胞定位实验的结果表明，四种蛋白在原生质膜和液泡膜上都有表达，OsCBL2、3、6蛋白的表达较强，而OsMTN蛋白表达较弱。另外，本研究通过SarH74L和Brefeldin A干扰对OsMTN与OsCBLs互作蛋白的定位途径进行了探索，结果表明，pSPYCE-OsMTN与pSPYNE-OsMTN、pSPYNE-OsCBL2、pSPYNE-OsCBL3、pSPYNE-OsCBL6所形成的互作蛋白复合体可能既不经COPⅠ衣被小泡途径运输，也不经COPⅡ衣被小泡途径运输。此外，为了明确OsCBL3与OsMTN的蛋白互作机理，本研究通过双分子荧光互补技术和酵母双杂交试验进一步分析了OsCBL3与OsMTN互作必需的关键氨基酸残基。结果表明，决定OsCBL3与OsMTN互作的必须氨基酸位于第109位到第199位氨基酸区段。这为揭示OsCBL3与OsMTN的蛋白互作机理提供了进一步的理论依据。