丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus,HCV)是引起慢性肝炎,肝硬化,肝癌的主要病原体之一。目前尚无有效预防HCV感染的疫苗,而且有近一半的HCV感染者用现有的疗法不能被治愈。HCV的感染已经成为严重影响人类健康的公共卫生问题之一,近年来已成为全球病毒学研究的热点。　　 本研究论文分为以下四个主要部分:　　 第一章,引言。首先,综述了HCV的流行病学、分类、分子生物学特点、生活周期以及体外细胞培养系统的研究概况。然后,简要介绍了MAPK信号通路和MKPs的相互关系。最后介绍了本研究的目的、内容和意义。　　 第二章,含双报告基因的HCV感染性细胞培养系统的建立和鉴定。通过在JFH1的5NTR后插入AC-hRLuc-2A片段引入hRLuc基因,或者是在NS5A的C末端插入EGFP基因或hRLuc基因,先构建了几种含报告基因的单顺反子HCV全基因组的cDNA克隆,之后获得了含报告基因的具有感染性的HCV病毒。结果表明在NS5A的C末端420aa处插入报告基因的策略要优于在399aa处插入。免疫荧光实验表明NS5A-GFP融合表达后与HCVCore和NS3蛋白共定位在细胞质中。含双报告基因的病毒感染细胞后,两种报告基因hRLuc和EGFP的表达水平和HCV的RNA水平、NS3蛋白水平以及上清中病毒粒子的感染性有很好的一致性。双报告基因及病毒RNA水平、NS3蛋白水平检测证实了利巴韦林对HCV复制抑制的剂量依赖效应。根据荧光素酶活性数据计算得到的利巴韦林的EC50为24μM。在利巴韦林抑制实验中,能有效测定药物抑制率的报告基因的检测时间范围较宽。该系统将成为研究HCV与宿主细胞相互作用和进行抗HCV药物筛选的有力工具。　　 第三章,含双报告基因的HCV亚基因组复制子系统的建立和鉴定。描述了几种HCV亚基因组复制子cDNA克隆的构建和含双报告基因的稳定复制子细胞系的筛选过程。含双报告基因的稳定复制子细胞系中报告基因hRLuc和EGFP的表达水平与HCV的RNA水平以及NS3蛋白水平有很好的一致性,同样也呈现出利巴韦林剂量依赖性抑制。根据荧光素酶活性数据计算得到的利巴韦林EC50为40μM。该系统可用于HCV复制研究和抗HCV药物筛选。　　 第四章,MKP1对HCV复制影响的研究。我们发现Huh-7.5.1细胞在电转JFH1RNA或感染JFH1病毒后,在感染高峰之后病毒都能在细胞中维持低水平感染。在病毒感染高峰期细胞中,基因芯片分析发现MAPK信号通路的抑制蛋白家族MKPs的一些基因表达有明显上调,并用RT-QPCR对其中部分基因的表达做了进一步验证。同时我们也检测了MKP1蛋白水平的变化情况,发现MKP1蛋白表达的增加与HCV的复制水平呈正相关性。接下来我们检测了HCV感染后MAPK信号通路的三种主要途径的激活情况,结果表明ERK和P38先被明显激活然后又失活,JNK未检测到明显活化。MAPK的激活变化与MKP1的表达有一定的相关性。接下来我们在含双报告基因的感染性细胞培养系统中检测了几种MAPK信号通路抑制剂和MKP1的抑制剂对HCV复制的影响。结果表明ERK的抑制剂对病毒的复制有促进作用,而P38和JNK的抑制剂对HCV的复制有抑制作用；MKP1的抑制剂triptolide对HCV的复制有抑制作用,而Ro-31-8220对HCV的复制无明显影响。这些结果表明HCV感染细胞后,可能通过上调MKP1抑制MAPK信号通路的活化进而逃逸宿主细胞的先天免疫,维持病毒复制,对HCV的慢性持续性感染的建立可能起到了一定的作用。