目的环状RNA(circular RNA,circRNA)是一种特殊的内源性非编码RNA(non-coding RNA,ncRNAs)。多项研究均表明,大量的环状RNA在肺癌(Lung Cancer,LC)中表达失调并影响病情的进展和预后。但是,环状RNA在肺癌中的分子机制还未得到明确阐明。本文通过对芯片测序的结果进行生物信息学分析、选取特定的环状RNA(circZMYM4)分子,旨在探究circZMYM4在肺癌中的作用,明确circZMYM4的生物学功能及影响肺癌的分子机制,从而为肺癌的预后提供分子标志物,甚至为肺癌的治疗提供潜在的干预靶点。方法(1)筛选并鉴定与肺癌相关的circRNA:从公共数据库的组织芯片中寻找和筛选在肺癌和癌旁组织中有显著差异表达的环状RNA(circZMYM4)。通过特异性反向引物进行逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)、琼脂糖凝胶电泳、Sanger测序及核酸外切酶(RNase R)耐受实验,对circZMYM4的环状结构、成环位点及稳定性进行检测。通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)检测circZMYM4在肺癌及癌旁组织、肺癌细胞及正常肺上皮细胞中的表达情况,明确circZMYM4在肺癌中是否存在表达失调。通过RNA荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)了解circZMYM4在细胞内的定位。(2)探究circZMYM4的生物学功能:在A549肺癌细胞系中过表达circZMYM4,通过Transwell、MTT和EdU分别检测细胞的迁移和增殖情况。建立裸鼠肺癌皮下移植瘤模型,通过对移植瘤大小和重量的监测,分析过表达circZMYM4后是否能对裸鼠皮下移植瘤的生长产生影响。(3)探索circZMYM4调控肺癌的作用机制:使用特异性circZMYM4探针进行RNA pulldown实验及质谱鉴定,寻找可与circ ZMYM4结合的目标蛋白(YBX1),并通过RNA-IP实验反向验证YBX1结合circZMYM4的能力。改变A549细胞中circZMYM4的表达量,通过Western blot检测YBX1的表达量是否变化;同时通过免疫荧光实验检测YBX1在细胞中的定位是否改变。最后,对裸鼠肺癌皮下移植瘤模型的瘤体进行免疫荧光实验并检测YBX1在细胞中的定位变化,验证circ ZMYM4是否通过YBX1影响肺癌实体瘤的发展。结果(1)目标circRNA的筛选与鉴定:通过对组织芯片中的5对肺癌及癌旁组织的环状RNA进行筛选,发现circZMYM4在肺癌及癌旁组织中表达差异最为明显(在肺癌中下调5.4倍,p<0.05)。在RT-PCR和凝胶电泳实验中,使用针对circZMYM4的反向引物,以cDNA为模板可以得到扩增产物,但以基因组DNA(gDNA)为模板无法得到扩增产物,证明circZMYM4存在环状结构,Sanger测序结果展示了成环位点处的基因序列;RNase R实验表明环状的circZMYM4比线性的mRNA更加稳定。qRT-PCR结果证实,与癌旁组织相比,circZMYM4在肺癌组织中呈明显低表达(37/38,97.4%);以人正常支气管上皮细胞BEAS-2B为对照,circZMYM4在多种肺癌细胞系(A549、HCC2279、H460、H3255、H1299、HCC4006及PC9)中表达亦明显下降(P<0.05);通过FISH实验发现circZMYM4主要定位在肺癌细胞的细胞浆中。(2)探究circZMYM4的生物学功能:通过一系列生物学功能试验,我们发现在细胞水平上过表达circZMYM4后,A549细胞的增殖和迁移能力明显下降。动物水平上,裸鼠皮下移植瘤模型显示,过表达circZMYM4可明显抑制肺癌实体瘤的生长。(3)探索circZMYM4调控肺癌的作用机制:生物素标记的circZMYM4 pulldown探针可特异性结合circZMYM4,通过质谱实验对结合蛋白进行鉴定,最终确定目标蛋白为YBX1。通过RNA-IP实验进一步验证YBX1和circZMYM4是相互结合的。Western blot结果显示,在肺癌细胞系中circZMYM4表达量的变化并不影响YBX1蛋白的降解。通过免疫荧光实验,在细胞和动物水平均证明增加肺癌细胞中circZMYM4的表达可以促使YBX1从细胞核向细胞质中转移,从而抑制YBX1在细胞核中的促癌功能;反之减少circZMYM4的表达可以增加YBX1在细胞核中的定位。结论本研究通过利用人体肺癌样本、肺癌细胞系及构建动物荷瘤模型,探究circZMYM4在肺癌发展中的作用及其机制,实验结果表明:(1)circZMYM4是高度稳定的环状RNA,其主要定位在肺癌细胞的胞质中。其在肺癌组织和细胞中的表达均明显下调,提示circZMYM4可能在肺癌发生发展过程发挥重要的调控作用。(2)过表达circZMYM4可明显抑制肺癌细胞的增殖和迁移能力,并抑制实体瘤的生长。(3)circZMYM4可通过结合YBX1并抑制其核转移,从而抑制下游YBX1的生物学功能,最终阻碍肺癌的进展。本研究通过对circRNA在肺癌中的功能及潜在机制的探索,为肺癌的治疗提供新的思路和理论依据。