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异育银鲫(Carassius auratus gibelio)因具有个头大、生长快、肉质鲜美、营养丰富等优点而受到人民群众的喜爱,其产量持续增长,带来了巨大的经济效益和社会效益。然而,大规模病害的爆发阻碍了异育银鲫养殖业的发展,其中病害主要有寄生虫病、细菌性疾病、真菌性疾病、病毒性疾病等。2012年来,异育银鲫养殖区爆发了大规模“鳃出血病”,该病死亡率极高,造成重大经济损失,经鉴定引起这种疾病的是鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)。CyHV-2最早于1992年在日本的金鱼中被发现,因其是第二个从鲤科鱼中分离出的病毒,国际病毒系统分类与命名委员会命名其为鲤疱疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus Ⅱ,CyHV-2),因其可造成鲫鱼造血组织器官坏死,因此,又称该病毒为“疱疹病毒性造血器官坏死症病毒”,(Herpes viral haematopoietic necrosis virus,HVHNV)。鲤科鱼疱疹病毒目前分为三个型,分别为鲤痘疮病毒(Carp pox herpesvirus,Cyprinid herpesvirus,CyHV-1);鲤疱疹病毒 Ⅱ 型(CyHV-2)及锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,Cyprinid herpesvirus3,CyHV-3)。目前,对CyHV-3的研究较多,而对CyHV-2的研究还处于起步阶段。本论文首先利用SYBR Green建立了异育银鲫CyHV-2病毒数量的定量方法;然后对ORF72基因进行了克隆、表达和抗体制备;最后分析了病毒感染前后异育银鲫血液生化指标的变化。这些数据为进一步了解该病毒的致病机理、寻找有效防治办法提供了有价值的参考依据。本论文的主要研究内容包括如下三个方面:1.异育银鲫中CyHV-2载量测定方法的建立本研究根据CyHV-2 ORF16基因序列设计引物,利用SYBR Green法建立了异育银鲫中CyHV-2的Realtime PCR定量检测方法,首先绘制出标准曲线,然后对各组织中CyHV-2的拷贝数进行测定,分析出该病毒在不同组织中的表达分布,结果发现脾、肾组织中表达量较高,鳃、肝、肠、肌肉等组织中表达量较低。这些数据为监测、预防及控制CyHV-2的传播提供了有价值的信息。2.ORF72基因的克隆、蛋白表达和抗体制备本研究根据CyHV-2-ORF72基因序列设计引物,通过PCR扩增得到CyHV2-ORF72,该基因序列全长为1113bp,可编码370个氨基酸的蛋白。该基因的PCR产物与pET-28a表达载体连接,构建重组原核表达载体pET-ORF72,将其转入大肠杆菌感受态细胞Transetta(DE3)中,经IPTG诱导表达得到了分子量约为45 kDa的重组蛋白,与预测的蛋白大小基本一致。将纯化的重组蛋白皮下多点免疫注射新西兰大耳兔制备了 ORF72的多克隆抗体,经Western blotting检测抗体能与病毒粗提液有良好的反应,特异性较好。这些数据为下一步建立疫苗和免疫检测方法奠定了基础。3.CyHV-2感染对异育银鲫血液生化指标的影响分析本研究对感染CyHV-2前后异育银鲫血液的生理生化变化及对血清酶活的影响进行了分析,研究发现:患病鱼血中除白细胞(WBC)数量显著升高(p<0.05)外,红细胞(RBC)、血红蛋白含量(HB)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)均极显著下降(p<0.01),红细胞压积(HCT)也表现出下降但差异不显著(p>0.05)。病鱼组和健康鱼组相比,血液中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)和尿素氮(BUN)的含量也极显著升高(p<0.01);此外,病鱼中血清的总抗氧化能力(T-AOC)、酸性磷酸酶(ACP)、谷胱甘肽-S转移酶(GST)、过氧化氢酶(CAT)这四个酶活力显著性升高(p<0.01),这些数据为进一步揭示CyHV-2病毒的致病机制奠定了基础。