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菘蓝(IsatisindigoticaFort.)为十字花科菘蓝属两年生草本植物。根为板蓝根、叶为大青叶来源之一，均为常用中药，具有清热解毒、凉血利咽之功效，临床上常用于流行性感冒、流行性腮炎、流行性乙型脑炎、急慢性肝炎、带状疱疹等疾病的治疗。菘蓝中所含的木脂素类化合物7S,8R,8’R-(+)-落叶松树脂醇-4,4’-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，即直铁线莲宁B(clemastaninB),对不同亚型人流感病毒与禽流感病毒均有显著抑制作用，是菘蓝抗病毒重要活性物质基础之一。然而，直铁线莲宁B在菘蓝原植物中含量较低，且主要存在菘蓝根部，含量最高仅为0.900mg·g-1（DW），这也在很大程度上限制了其在临床上的应用。因此，通过分子生物学等研究手段解析直铁线莲宁B生物合成途径，利用代谢工程调节菘蓝中直铁线莲宁B的含量或直接通过合成生物学策略合成这类化合物，对菘蓝药用资源的可持续利用具有重要意义。 目前，参照模式植物拟南芥和其它植物的研究，菘蓝木脂素的合成途径已初步阐明，直铁线莲宁B生源合成途径上大多关键酶基因被陆续鉴定，但是催化关键糖基化修饰的糖基转移酶基因仍然没有被鉴定。本研究基于菘蓝的转录组测序，筛选菘蓝直铁线莲宁B生物合成关键糖基转移酶并进行进一步的功能研究。 首先对菘蓝不同组织及其毛状根转录组测序分析，利用NCBI，KEGG，Swiss-prot，GO等数据库，注释直铁线莲宁B生物合成途径主要基因，并注释了120个糖基转移酶基因。据文献报道，UGT71、UGT72、UGT88家族的糖基转移酶可能催化苯丙素类生成相应的葡萄糖苷，对注释的UGT序列同源性比对，找到了14条属于这三个家族的糖基转移酶。克隆这14条候选UGT并构建重组原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达，分别提取粗酶用于体外酶促反应。以落叶松树脂醇为底物，筛选可以催化落叶松树脂醇生成直铁线莲宁B的糖基转移酶，进而对筛选获得的糖基转移酶进行相关生化特性研究，同时构建菘蓝转基因毛状根体系进行体内验证，解析直铁线莲宁B生物合成的糖基化机制，为今后基于糖基转移酶的菘蓝代谢工程打下基础。主要结果如下： 1.对菘蓝的转录组测序获得了基本转录组数据，利用NCBI公共数据库和KEGG对参与直铁线莲宁B生物合成途径的关键酶基因做了注释，通过氨基酸序列比对筛选了14条属于UGT71、UGT72、UGT88家族的UGT基因； 2.通过设计全长PCR克隆引物，对这14条候选糖基转移酶基因进行全长cDNA的克隆，最终成功克隆了10条候选糖基转移酶，构建重组原核表达载体，提取粗蛋白作体外酶促反应，并用UPLC和Q-TOF-MS/MS进行产物鉴定，发现UGT142、UGT146、UGT236均能催化落叶松树脂醇生成落叶松树脂醇-4-O-β-D-葡萄糖苷、落叶松树脂醇-4’-O-β-D-葡萄糖苷、直铁线莲宁B； 3.生物信息学分析结果显示，克隆的UGT142基因的ORF区为1461bp，编码486个氨基酸残基，理论分子量（MW）为53.98kDa，等电点（PI）为5.46；克隆的UGT146基因的ORF区为1461bp，编码486个氨基酸残基，理论分子量（MW）为54.19kDa，等电点（PI）为4.91；；克隆的UGT236基因的ORF区为1449bp，编码482个氨基酸残基，理论分子量（MW）为53.77kDa，等电点（PI）为4.84。这三个候选UGT的亲水性均较强，可能为非分泌蛋白、非膜蛋白。二级结构均主要含有α螺旋、β折叠，无规则卷曲。保守PSPG结构域分析表明，这三个基因的PSPG结构域在C端的位置、大小和亚麻参与开环异落叶松树脂醇糖基化UGT74S1、拟南芥中松脂素糖苷合成相关UGT71A9的PSPG结构域相似。系统发育分析表明，UGT146、UGT236属于UGT71家族，且这两个蛋白的同源性很高；另外UGT146和拟南芥UGT71B2序列相似性最高，UGT236则与拟南芥UGT71B6同源性最近，而UGT142独立成支。拟南芥的UGT71B2、UGT71B6与生长素及苯丙烷代谢相关，从而推测UGT146、UGT236参与菘蓝木脂素类化合物的合成。尽管这三个基因在体外均能糖基化生成直铁线莲宁B，但其在氨基酸序列上的分化预示了它们体内功能比如在底物的偏好性上可能存在一定的分工。 4.基因表达分析结果显示，UGT146和UGT236表达模式相似，在花、叶、茎中表达量相对较高。UGT142表达模式与UGT146、UGT236表达模式明显不同，UGT142在菘蓝毛状根中大量表达，但在菘蓝不同组织部位均微量表达。 5.酶反应动力学参数测定结果显示，3个UGT均能催化落叶松树脂醇、松脂素、马台树脂醇、开环异落叶松树脂醇生成相应葡萄糖苷，具有一定底物杂泛性。但三个UGT对上述底物存在一定偏好性，其中UGT142对开环异落叶松树脂醇的亲和力相对较高，UGT146与落叶松树脂醇结合能力相对较高；尽管UGT236和UGT146氨基酸序列有较高同源性，但和UGT146相比，其与上述四个底物结合能力均比较弱。以上结果说明了本研究鉴定的3个UGT均可能参与菘蓝木脂素类成分的糖基化，但它们在亲和力存在一定差异。 6.为了进一步验证UGT142、UGT146、UGT236的功能，分别构建了这3个基因植物干扰载体和过表达载体，获得了菘蓝转基因毛状根。转基因毛状根株系中主要木脂素类成分含量测定结果显示，当UGT142、UGT146、UGT236表达量水平均下调时或当其中一个基因或两个基因表达水平下调时，毛状根株系中松脂素二葡萄糖苷的含量明显降低，最低分别为3.58μg·g-1、2.55μg·g-1、1.24μg·g-1，均低于对照组含量的二分之一，这说明干扰这三个基因均影响菘蓝糖基化合成松脂素二葡萄糖苷；而UGT142-OX毛状根株系中松柏苷、落叶松树脂醇-4-O-β-D-葡萄糖、落叶松树脂醇-4’-O-β-D-葡萄糖含量均有一定幅度升高，而松脂素二葡萄糖苷含量显著提高，最高含量为931.12μg·g-1，是对照组的37.44倍，这说明了过表达UGT142能显著提高菘蓝毛状根中松脂素二葡萄糖苷的含量，因此推测UGT142是催化生成松脂素二葡萄糖苷的关键糖基转移酶。当UGT142、UGT146、UGT236表达量水平均下调时，毛状根株系中落叶松树脂醇-4-O-β-D-葡萄糖、落叶松树脂醇-4’-O-β-D-葡萄糖、直铁线莲宁B的含量显著降低，分别为19.80μg·g-1、2.26μg·g-1、20.26μg·g-1，约对照组的五分之三、百分之一、百分之六，这说明UGT142、UGT146、UGT236均可能参与了菘蓝落叶松树脂醇-4-O-β-D-葡萄糖、落叶松树脂醇-4’-O-β-D-葡萄糖、直铁线莲宁B的生物合成；而UGT146-OX毛状根株系中所检测的木脂素糖苷成分均有所提高，其中落叶松树脂醇-4-O-β-D-葡萄糖、落叶松树脂醇-4’-O-β-D-葡萄糖、直铁线莲宁B含量升高最明显，最高分别达到800.14μg·g-1、458.24μg·g-1、1466.98μg·g-1，分别是对照组的4.33倍、8.22倍、7.95倍，当过表达UGT146时，更有利于菘蓝落叶松树脂醇-4-O-β-D-葡萄糖、落叶松树脂醇-4’-O-β-D-葡萄糖、直铁线莲宁B的生物合成，从而推测UGT146可能主要参与菘蓝落叶松树脂醇-4-O-β-D-葡萄糖、落叶松树脂醇-4’-O-β-D-葡萄糖、直铁线莲宁B的糖基化。UGT236-RNAi毛状根株系中松柏苷含量显著降低，最低含量为1.44mg·g-1，约是对照组的十分之一，这说明干扰UGT236明显抑制菘蓝毛状根中松柏苷的生物合成；UGT236-OX毛状根株系中落叶松树脂醇-4-O-β-D-葡萄糖、落叶松树脂醇-4’-O-β-D-葡萄糖、松脂素二葡萄糖苷含量均有所提高，而松柏苷含量显著提高，最高含量为556.90mg·g-1，是对照组的20.89倍，这说明了过表达UGT236能显著提高菘蓝毛状根中松柏苷的含量，因此推测UGT236是催化松柏醇生成松柏苷的关键糖基转移酶。 综上，本研究基于菘蓝转录组测序，筛选克隆了可能参与菘蓝抗病毒活性成分直铁线莲宁B生物合成的关键糖基转移酶候选基因，通过原核表达结合体外酶促筛选获得了三条可能参与直铁线莲宁B生物合成的糖基转移酶基因。进一步的生化特性分析、转基因毛状根构建结果表明，这三个基因均参与直铁线莲宁B生物合成途径中的糖基化修饰但存在较明显的分工，UGT142、UGT146、UGT236均参与了落叶松树脂醇-4-O-β-D-葡萄糖、落叶松树脂醇-4’-O-β-D-葡萄糖、直铁线莲宁B的生物合成，其中UGT146可能主要参与落叶松树脂醇-4-O-β-D-葡萄糖、落叶松树脂醇-4’-O-β-D-葡萄糖、直铁线莲宁B的糖基化；UGT142是催化松脂素生成松脂素二葡萄糖苷的关键糖基转移酶；UGT236在菘蓝松柏苷的生物合成中起关键作用。本研究基本阐明了菘蓝直铁线莲宁B生物合成途径的糖基化机制，为今后基于糖基转移酶基因的菘蓝代谢工程提供基础，同时本研究所用的菘蓝毛状根体系也为木脂素类化合物的生物合成或糖基化修饰提供了一个潜在的平台。