近年来,工程蛋白质和材料科学在药物靶向运输的开发方面具有非常有希望的前景。药物靶向运输具有改善药物包载,运输和靶向效率的巨大潜力。这些系统具有以下几个优点:1)保护药物的过早降解或与其生物环境的相互作用,2)增强药物对所需组织的吸附,3)药物组织分布的控制。用于药物递送的衣壳通常分为两类:病毒和非病毒(或合成的)。病毒是药物包载的常用载体,病毒颗粒是基于简单的超分子自组装和自分解过程包载客体分子。病毒对包载病毒核酸具有一些优势,如形态均匀性,生物相容性和易于功能化,其具有高度保守的自组装成衣壳的能力而无需其病毒基因组。常用的病毒载体有豇豆褪绿斑驳病毒(CCMV),CCMV是植物病毒,其蛋白质亚基排列为20个六聚体和12个五聚体,形成直径为28 nm的二十面体壳。每种CCMV外壳蛋白含有190个氨基酸,氨基酸的N-末端位于病毒衣壳的内部。N末端(氨基酸1-25)上的残基主要是碱性的,其有助于与带负电荷的RNA相互作用。CCMV的内径为18nm,支持足够的包载空间。CCMV内表面中丰富的精氨酸和赖氨酸残基提供高正电荷密度。CCMV具有动态结构,外壳蛋白亚基能够通过改变pH和离子强度条件在体外自组装和分解。将病毒基因RNA载入衣壳的有效性和特异性是一个极富挑战的分子识别问题。目前对于此类病毒是如何解决这一问题的还不是完全了解,但已提出有三个主要影响因素:衣壳内部的阳离子、蛋白质与RNA的质量比和结合部位的结构。1)衣壳内部的阳离子:利用病毒衣壳包载RNA的普遍特点是电荷互补性。静电相互作用在衣壳-RNA的形成中扮演者重要的角色,并且位于富含精氨酸模序(ARM)的N-端或C-端的正电荷残基对于RNA的结合非常重要。2)蛋白质与RNA的质量比:有研究发现在CCMV对核酸的包载中,蛋白质与RNA的最佳质量比为6:1时,这种质量比也导致了 RNA客体与富精氨酸模序的衣壳间近乎完美的电荷平衡。3)结合病毒衣壳的RNA模序:在缺乏其全基因组的环境下生产出的病毒衣壳蛋白通常会包载其宿主细胞RNA的多种混合物。不过病毒基因组RNA与衣壳的相互作用强于宿主细胞RNA,因为许多简单核糖核酸病毒衣壳的内表面拥有能与其基因组RNA的结构元素特异性相互作用的结构位点。因此如果找到特异性位点,利用其他的非共价相互作用,例如氢键和疏水相互作用等,相较于简单的电荷互补作用提供了更大程度的特异性。虽然病毒提供更高的药物包载效率,但是基于病毒的衣壳的安全性,非病毒衣壳是优选的。病毒衣壳可能引起人体免疫反应、诱变和致癌作用。非病毒纳米笼子不仅可以避免毒性和蛋白质结合相关的问题,而且还有助于靶向运输和从细胞内运输载体释放核酸。非病毒载体通常是阳离子脂质或聚合物,其由载体骨架组成。非病毒载体能够与质粒形成稳定的复合物,其可以通过官能团修饰以与生物材料结合以增强细胞相容性。阳离子脂质由附着于疏水脂质部分的阳离子头基组成。阳离子脂质具有三个主要成分:极性头部基团,其允许与核酸结合;脂质链,其允许通过亲水相互作用交联以形成胶束或脂质体;和连接体,其作为上述两个官能团之间的桥梁。由于它含有带正电荷的头部基团,因此对于RNA包载是有用的。在非病毒载药领域中,研究者们也有采用天然超分子载药系统进行药物包载。超分子系统的机制是弱的和可逆的非共价相互作用,例如疏水吸引力,氢键,范德华力和静电相互作用。由于弱的和可逆的相互作用,可以预期超分子系统在特定位点或在适合于药物在特定时间释放。天然存在的蛋白质自组装是最容易用于药物包载的应用,即流行的天然材料。它们的特征结构是尺寸均匀性和并且具有充足的空间足以包载许多小分子。本课题采用来源于超嗜热菌的二氧四氢蝶啶合酶(AaLS)形成的衣壳作为一个简单模型,检验关于包载RNA的一系列论点。AaLS是催化核黄素生物合成倒数第二步的酶,由60个相同单体构成的十二面体衣壳,且AaLS为人造核酸包载系统的设计提供了一个极为有利的支架。第一,可以利用大肠杆菌大量生产此蛋白,可获得较高产率;第二,AaLS衣壳高分辨率的晶体结构可以帮助核酸包载的设计工作;第三,此衣壳极为稳定(据报道溶解温度为120℃)具有较长的储藏寿命;第四,此衣壳的内径大约为9A,为客体RNA和其他大分子的载入提供了足够的空间;第五,此衣壳的内表面具有很好的电荷平衡性(静电荷为-1/每单体),并没有特殊的固有能力包载RNA。在之前的研究工作中,对AaLS进行合理性设计,增加其内部负电荷,使其突变为AaLS-neg,已经证明它可以在大肠杆菌中包载带有十个精氨酸(R10)标签的正电荷蛋白质。接着对AaLS-neg进一步突变,使其内部具有更多的阴离子,称其为AaLS-13,它也可以包载大量带有R10标签的正电荷蛋白质和其他具有甚至更多阳离子的蛋白质。因此对于蛋白质客体来说,AaLS衣壳的内部负电荷似乎与通过共产而被包载的客体蛋白质的正电荷量相关。有趣的是,对于包载阳离子蛋白质来说一般AaLS-13具有更强的包载能力,尽管它只包载一种特定的客体蛋白质(带有R10标签的HIV蛋白酶)。此结果证明电荷互补是一种有效的手段来增强包封率,但电荷互补对于包载特异性的影响程度还不明确。将蛋白质表面赋予“超电荷”提供了一个简单的方法使任何给定的蛋白质框架在体外具有核酸结合的活性。我们使用这种方法,将AaLS衣壳内表面赋予“超电荷”,实现其体内包载RNA的能力。野生型AaLS的内表面由每个单体的17个氨基酸决定。其中三个残基具有正电荷(R83,R127,and K131),四个残基具有负电荷(D90,D119,E122,and E126),因此一个单体具有-1个静电荷,整个衣壳具有60个单体,即-60个静电荷。通过对单体的四个位点进行突变(T86R,D90N,T120R,and E122R),我们得到了突变体AaLS-pos,每个单体的静电荷为+4,整个衣壳的静电荷为+240。并且基于对病毒包载核酸的原因,精氨酸对核酸的包载也十分重要。突变体在每个单体上提供了一组精氨酸,形成衣壳后,可以组成一个巨大的结合表面结合细胞内RNA分子。本课题利用蛋白AaLS-pos衣壳包载不同分子大小的RNA客体,从而找出蛋白AaLS衣壳的内部电荷与大小适宜的RNA客体之间的关系。用于蛋白质包载的基于pACYC载体的质粒将被构造,在大肠杆菌中表达105个核苷酸片段的Broccli-F30 RNA适配子。具有194、240、300、360、420和540个核苷酸长度的表达基因盒将被合成并编码转录,为将其载入蛋白AaLS-pos衣壳中,每个转录物将与AaLS-pos 在大肠杆菌 BL21(DE3)细胞中共同合成。根据已有步骤,衣壳将用镍离子亲和色谱和分子排阻色谱根据常规步骤进行纯化,用考马斯亮蓝分析蛋白浓度,每升的细菌培养液中蛋白产量通常为25 mg。用苯酚:氯仿从纯化后的衣壳中提取RNA,使用Nanodrop测定RNA的浓度,每毫克蛋白的RNA产量通常为63μg。利用紫外—可见光谱(A260)测定每个蛋白质样品内RNA包载的总量(内源性胞内RNA和异源性Broccoli-F30 RNA),利用荧光检测包载Broccoli-F30 RNA的量(商业通用染料DFHBI-1T与Broccoli-F30适配体结合后会发出荧光)。3,5-二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮(DFHBI),在溶液中是非荧光的,但在折叠蛋白内是高荧光的,该RNA适体称为“Spinach”或“Broccoli”,发射出绿色荧光。DFHBI与细胞一起孵育时并低背景荧光,有利于RNA检测。然而,适体似乎在细胞中表现出的功能较差,可能是由于RNA容易降解或在细胞内没有很好地折叠。于是有研究者开发了一个名为改良的DFHBI衍生荧光团DFHBI-1T,(Z)-4-(3,5-二氟-4-羟基亚苄基)-2-甲基-1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-咪唑-5(4H)-酮)(DFHBI-1T)。DFHBI-1T 具有更高的消光系数,更低的背景荧光和更宽的线性检测范围。较短的西兰花适体适用于一些不含大标签的RNA。Broccoli在体外具有更高的折叠效率,与Spinach2相似,具有减少镁离子对折叠的依赖性并且还提高热稳定性的优点,西兰花具有高折叠,不需要tRNA支架。研究人员设计了一种天然三通接头,将适体插入高度结构化的RNA支架中,以提高折叠效率,鉴定细胞中异源适体的有效表达和标记。将不同长度的Broccoli-F30 RNA从已纯化的蛋白AaLS-pos里和从大肠杆菌BL21(DE3)里提取出来,进行荧光实验,比较从蛋白里提取的RNA和从大肠杆菌里提取的RNA的荧光强度,从而得出被包载的RNA的比值。并且与紫外吸光度的比值计算出来并进行比较,观察不同长度的Broccoli-F30RNA的不同比值。荧光实验可以从RNA适配体与荧光染料DFHBI-1T结合从而发射的荧光强度来得到不同长度RNA的包载量,从而验证结论是否支持电荷匹配假设。DFHBI-1T的最佳浓度为100 μM,从蛋白里提取的RNA加入量为104 μg,从细胞里提取的RNA加入量为121 μg,使用8 mMMgCl2作为辅助离子,PBS作为缓冲体系,总体系体积为200 μL。同样我们也采用了实时荧光定量PCR去比较不同长度RNA在蛋白AaLS-pos里的包载量,通过在PCR扩增过程产生的荧光信号来实时监测PCR的进程。通过实时荧光定量PCR筛选出稳定表达的管家基因cysG,而最佳的RNA加入量为0.01 μg和引物浓度为0.3 μM,在该条件下的PCR实验结果都较稳定。由荧光实验和实时荧光定量PCR结果得知,最大值均出现在240个核苷酸的Broccoli-F30RNA。基于我们对蛋白AaLS-pos衣壳进行的突变,使得蛋白AaLS-pos衣壳具有240个正电荷,从而验证了电荷匹配的假设。该课题有助于我们增强对病毒功能的理解:病毒是一个复杂的纳米机器,拥有许多相互关联的功能,有时蛋白质衣壳的一部分结构会承担着多种功能,我们很难将一些基础功能例如包载RNA与其他相关功能分离开。因此我们将利用AaLS这一优良载体从基础开始研究RNA包载过程是如何在衣壳内部建立的,这一基础手段将详细的检验电荷互补性、蛋白质与RNA质量比和结构模序三个因素对于蛋白质衣壳包裹RNA能力的相关性和限制性,这可以使我们进一步了解这一过程。且深刻理解病毒如何识别RNA可以帮助我们设计新型手段来开发抗病毒药物。开发新型RNA运输系统:蛋白质衣壳对于药物转运是一个引人注目的载体。发展临床有效的RNA疗法(例如小干扰RNA、反义RNA和寡核苷酸适配子)最主要的挑战是如何将这些小分子有效且靶向性的运输到细胞内。基于衣壳的药物转运系统通常试图模拟病毒的生命周期。从病毒中获取灵感,蛋白质衣壳代表了一类很有前途的运输工具应用于装载RNA。的确,对病毒衣壳封装RNA的理解可以为非天然RNA、蛋白质和小分子提供新型的装载系统。非病毒衣壳,例如不会有任何感染风险的AaLS,相较于一些病毒给药系统来说是一大优势。本项目的总体目标是将病毒样的能力赋予AaLS衣壳,最终最大限度的掌控其在生物体内的行为。这项工作将为更加成熟可控的且更具有应用价值的治疗性RNA转运系统打开一扇大门。