凝血酶是人体内发挥止血功能和与血栓形成相关的核心蛋白酶,是临床上检测体内血栓形成倾向和衡量止血能力的关键所在。但是,目前临床检测凝血酶的方法都是只能间接反映出凝血酶生成量,还存在着一些缺陷。比如,检测前对于病人要求较高,检测操作复杂且容易受到外界干扰等。所以,临床上亟需一种能够检测凝血酶含量的快捷方法。现在,基于抗原抗体作用的免疫分析法仍然是检测凝血酶含量的主流方法。而在生物传感领域,近年来核酸适配体却越来越多地替代抗体成为了凝血酶检测探针的热门材料。因为适配体不但拥有跟抗体相近的高亲和能力,而且具有尺寸和分子量小、易于制备和修饰、序列可调、具有折叠可逆性以及稳定性高等特性。因此,基于适配体的生物传感器有望应用于临床样本中的凝血酶检测。而纳米孔分析技术的出现也为蛋白质这类生物大分子的高通量、高灵敏检测提供了一种新的策略。当蛋白质分子通过与其尺寸相近的纳米孔时,会引起孔道层内光学性质的改变,这一改变可以反映出蛋白质信息。基于这一原理,本文以适配体修饰的通孔式多孔硅纳米孔道作为生物识别元件,初步探索了用反射干涉光谱法在检测凝血酶方面的应用。本课题的主要内容如下:(1)综述了核酸适配体亲和探针在生物传感方面的研究进展,其中着重介绍了适配体传感器在蛋白质检测方面的应用。本章还概述了固态纳米孔分析技术和基于适配体修饰的纳米孔传感技术。其中还介绍了多孔硅作为一种阵列纳米孔材料在生物传感,尤其是作为反射干涉传感器敏感材料的研究现状,同时也介绍了核酸探针在多孔硅传感器中的应用。(2)构建了一种以通孔式多孔硅薄膜作为反射干涉元件,以凝血酶适配体作为捕获探针的生物传感器,应用于凝血酶的定量检测。利用了多孔硅的纳米孔道特性,将其表面通过一系列化学修饰连接上凝血酶适配体,用于捕获流过孔道的目标凝血酶分子。一旦孔壁截留住凝血酶,多孔硅层的平均折光率大大增加,从而引起反射干涉光谱的红移和其有效光学厚度的变化。基于这一原理,构建了一种检测凝血酶的免标记光学传感器,其具有高灵敏度、高特异性、较宽的检测范围、低检出限以及可再生能力。和传统的封闭式多孔硅传感器相比,通孔式多孔硅传感器响应速度更快(<2h)且灵敏度也要更高。通过实验还发现,溶液环境(比如pH、盐离子等因素)、孔径以及适配体种类的变化都能够改变纳米孔道内的适配体捕获能力。(3)基于前一章中的传感原理,通过简单的适配体序列设计完成了临床样本中凝血酶含量的检测,其线性检测范围为10-1000 nM,而且检出限可达纳摩尔级别,具有临床意义。研究发现,所构建的多孔硅传感器几乎不受背景干扰,在缓冲液和血清中的校准曲线没有显著差异。而且对于临床样本,该传感器回收率均保持在90-110%之间且准确度较高(相对标准偏差<10%)。这一检测方法与酶联免疫分析实验对比也没有显著性差异,证明了方法的可靠性。通过调节核酸探针上适配体序列数目增加了凝血酶结合位点并且构建了一种双位点传感器,进一步提升了适配体传感器的灵敏度。