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研究背景:卵巢癌是发生于卵巢组织的恶性肿瘤,临床上可出现下腹不适、腹痛、腹部肿块、月经紊乱、压迫等症状,卵巢癌起病多隐匿,早期不易发现,临床上确诊时大多数已为晚期,死亡率很高,严重威胁妇女健康和生命。尽管近年来手术技术的改进及一些新化疗药物的应用,卵巢癌的预后有了较大的改善,但5年存活率仍徘徊在30%左右,因此,寻求新的治疗方法成为当务之急。大量研究表明,细胞免疫在抗肿瘤免疫中起主要作用,过继性免疫治疗备受重视。过继性T细胞治疗是过继性细胞免疫治疗研究的重点,但对MHCI类分子阴性的肿瘤细胞无效,而NK细胞(Natural killer cell,NK细胞)由于表达MHCI类分子的抑制性受体-杀伤细胞抑制性受体(Killer inhibitory receptor,KIR),可以杀灭MHCI类分子阴性的肿瘤,随着对NK细胞研究的深入,目前NK细胞用于肿瘤免疫治疗成为研究热点。本研究所用的免疫细胞是中国科技大学免疫学研究所从非何杰金氏淋巴瘤的病人的外周血分离出来的一种NK细胞系,经检测此细胞具有与人NK细胞相似的表面分子特征和功能特点,对肝癌、胃癌、肺癌等多种肿瘤细胞具有杀伤活性,命名为NKG细胞。但尚无NKG细胞对卵巢癌细胞的杀伤作用的研究,因此,我们选择卵巢癌细胞作为靶细胞检测NKG细胞对其的杀伤活性,结果表明NKG细胞对卵巢癌的细胞具有较高的杀伤活性,杀伤率高于其它已构建成功的NK细胞系,包括NK-92、NKL及YT细胞。基于卵巢癌治疗现状及寻求新的治疗策略的考虑,安徽省立医院妇产科与科大免疫所共同申报了安徽省重大专项课题并获得批准。NKG细胞具有永生性,体内直接输注有增殖成瘤的危险,我们采用γ放射线对NKG细胞进行照射,抑制其增殖性而又保留了其的杀伤活性。因此,本课题研究内容包括:(1)NKG细胞的体外培养及安全性评价;(2)经不同剂量放射线照射后的NKG细胞的增殖活性、对HO-8910细胞及原代卵巢癌细胞的杀伤活性,并通过构建裸鼠荷人卵巢癌腹水瘤模型评价过继转输辐照后的NKG细胞的有效性,从而为NKG细胞用于卵巢癌过继性免疫治疗提供依据。目的探讨NKG细胞体外培养方法、增殖活性、对卵巢癌细胞的杀伤活性及对裸鼠荷人卵巢癌腹水瘤模型的治疗作用,为NKG细胞用于晚期卵巢癌的临床治疗提供理论依据。方法①用细胞袋进行NKG细胞大规模培养;②按照肿瘤细胞分离纯化试剂盒的说明书进行原代卵巢癌细胞的分离;③采用γ射线辐照仪在室温下辐照NKG细胞,照射后的细胞分别用于增殖、杀伤及对荷卵巢癌腹水瘤裸鼠治疗作用的研究;④3H-TdR掺入法检测照射后NKG细胞的增殖活性;⑤51Cr释放法检测NKG细胞、NK-92细胞对靶细胞的杀伤活性;⑥将0.2ml含5×105、1×106、2×106、5×106、1×107个的HO-8910细胞悬液,用1ml注射器将上述0.2ml细胞悬液经腹腔注入裸鼠体内,选择构建裸鼠荷人卵巢癌腹水瘤模型最佳细胞剂量;⑦在体内,照射后的NKG细胞对HO-8910细胞杀伤活性,将2×106个HO-8910细胞与1×107个800cGy照射后的NKG细胞混匀同时腹腔注入裸鼠体内,每周两次监测体重及腹围、成瘤率、成瘤时间及生存时间;⑧将NKG细胞重悬成浓度为6.67×107/ml的细胞悬液,800cGy辐照,分别过继转输入接种肿瘤细胞后第21和35天的裸鼠腹腔内,评价NKG细胞的有效性。结果①采用细胞袋培养7-10天,NKG细胞浓度可达1.1×106个/ml,细胞状态良好,活率≥90%;②3H-TdR掺入法检测NKG细胞的增殖情况:与未辐照组相比,所有剂量的放射线均可抑制NKG细胞的增殖活性,并随着放射线剂量的增加,NKG的增殖能力逐渐减弱,800cGy辐照后细胞无增殖能力;③51Cr释放法检测NKG细胞杀伤活性:NKG细胞经400cGy和800cGy放射线照射后,对K562细胞的杀伤活性无明显降低,而经1200cGy辐照后NKG细胞的杀伤率为活性明显降低,差异有显著性(P< 0.05),800cGy辐照后的NK-92细胞对HO-8910细胞杀伤率明显低于NKG细胞。辐照后的NKG细胞对原代卵巢癌细胞的平均杀伤率为61.1-15.5%;④裸鼠荷人卵巢癌腹水瘤模型的建立:腹腔接种HO-8910细胞数量不同,形成腹水瘤的时间及成瘤率不同,腹腔接种2.0×106肿瘤细胞后25-45天100%的小鼠出现腹水瘤,移植瘤及腹水经我院病理科常规石蜡包埋、H&E染色,其病理组织学形态与人卵巢浆液性囊腺癌相似,肝脏、脾脏及肠组织病理检查可见肿瘤浸润;⑤照射后的NKG细胞过继性转输有效性评价:HO-8910细胞与NKG细胞(1:5)同时注射组成瘤率由100%降到50%,成瘤时间由25-45天延长到90-135天,生存时间由61.5天延长至210.2天;⑥NKG细胞治疗21天成瘤鼠的结果显示,观察140天,未治疗组小鼠已全部死亡,中位生存期64.6天,治疗组仍有40%小鼠存活,中位生存期延长至119.6天;⑦对35天成瘤鼠,NKG细胞在一定程度可抑制肿瘤生长,提高生存率,小鼠生存期由64.2天延长至93.6天。结论800cGy照射后的NKG细胞不具有增殖能力,且最大限度地保留了对卵巢癌细胞的杀伤活性,过继性转输到荷瘤鼠腹腔内,可抑制肿瘤进展,延长生存期。