论文部分内容阅读
本实验室前期通过钙离子的亚细胞定位和激发子刺激小麦悬浮细胞后胞质Ca2+的浓度变化的研究等试验已经证明Ca2+/Ca M信号参与了小麦与叶锈菌互作早期的信号转导过程,并构建了Ta Ca M4-1的诱饵载体,通过酵母双杂交试验从受叶锈菌侵染的小麦c DNA文库中筛选出了Ta Ca M4-1下游互作蛋白的阳性克隆,Ta CAMTA4就是其中之一。在此基础上,利用5’-RACE PCR技术和序列拼接得到了Ta CAMTA4基因的c DNA全长。CAMTA(Calmodulin-binding transcription activator,钙调素依赖的转录激活因子)又称SR,是在进化中高度保守的一类转录因子家族,目前已经发现在拟南芥中该家族共有6个成员,这六个转录因子可以共同调节与生物胁迫和非生物胁迫相关基因的表达。通过前期的RT-q PCR试验,对受叶锈菌侵染的小麦叶片进行了Ta CAMTA4基因的表达量分析,发现不亲和互作体系中,Ta CAMTA4的表达量在接种后早期4-8 h呈下调趋势,说明Ta CAMTA4在小麦与叶锈菌互作过程中可能发挥着负调控作用。为了探究Ta CAMTA4在小麦抗叶锈病过程中的作用,本试验采用病毒(BSMV)诱导的基因沉默(VIGS)技术。首先进行了VIGS试验条件的优化,然后构建了Ta CAMTA4基因序列中两个不同片段的VIGS载体,并通过单独和混合接种病毒比较这几种情况下所引起的Ta CAMTA4的沉默效率;并对基因沉默后叶锈菌在小麦叶片上的发育状况进行了观察。在此基础上,对基因沉默的L10叶片于接菌(260)后不同时间点(前期:8 h,12 h;后期:20 h,36 h)进行转录组测序分析,以期找到与对照小麦叶片相比差异表达的基因,并获得这些基因的注释信息,初步分析了由Ta CAMTA4调控的基因表达概况。本试验获得的主要结果如下:1.对在小麦L10上实施的VIGS实验条件进行了优化,通过构建TaCAMTA4基因的两个VIGS载体,并混合两个病毒感染小麦,比较三者引起的沉默效率,确定了BSMV:Ta CAMTA4-2能够更好的沉默目的基因。2.在Ta CAMTA4沉默的L10叶片上叶锈菌小种165的生长发育受到抑制,在荧光显微镜下观察到菌丝团的面积较对照组有所减小;叶片上的孢子堆面积也比对照组减小。3.TaCAMTA4沉默的L10对叶锈菌260小种的抗性增强,发生HR的细胞面积有减小趋势。4.在Ta CAMTA4沉默的L10叶片上接种叶锈菌小种260,以未经沉默的材料做对照,在接种后不同时间点取样进行转录组测序,总共产出24185102400 nt的数据,通过de novo组装与拼接,得到72957条Unigene。5.所有的Unigene中,共有60948条注释到了NR,NT,Swiss-Prot,KEGG,COG,GO数据库。6.通过对差异基因的表达分析,发现TaCAMTA4沉默的叶片与未发生该基因沉默的叶片相比,在叶锈菌侵染前期(8 h,12 h)有3456个基因上调表达,576个基因下调表达;后期(20 h,36 h)有4180个基因上调表达,633个基因下调表达。7.通过RT-q PCR分析了5个小麦基因的表达量,验证了RNA-Seq得到的数据是可靠的。8.通过对差异表达基因进行GO分析和pathway分析,将这些基因进行了GO和KEGG分类,初步证明Ta CAMTA4调控了诸多生理过程,如代谢过程,刺激应答过程,生物调节等;在调节自噬的pathway中,自噬关键基因Ta ATG8因Ta CAMTA4沉默而上调表达;植物与病原互作的pathway中,CDPK,HSP90,PR1,WRKY也表现为上调表达。