目的研究神经轴突导向因子netrin-1及其受体UNC5B在体外微血管模型的作用。检测netrin-1受体在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)与新生血管化角膜中的表达差异。分析轴突导向因子netrin-1对角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)的作用。方法1．体外实验：原代培养HUVECs，检测不同浓度(10ng／ml-5000ng／ml)netrin-1作用72小时后对HUVECs增殖活性(CCK-8法)与迁移能力(Transwell小室)的影响。构建体外二维微血管模型，光镜下观察不同浓度netrin-1对体外微血管管腔形成的影响。采用RT-PCR检测HUVECs中netrin-1所有已知受体，包括UNC5A、UNC5B、UNC5C、UNC5D、DCC及neogenin共6种受体表达情况。构建UNC5BshRNA重组质粒，通过脂质体Lipofectamine 2000转染HUVECs，检测不同浓度(10ng ng／ml-5000ng／ml)netrin-1作用72小时后对对UNC5B沉默后HUVECs增殖活性与迁移能力的影响。光镜下观察不同浓度netrin-1对UNC5B沉默后体外二维微血管模型中管腔形成的影响。2．体内实验：60只SD大鼠，按随机数字表法随机均分成A、B、C、D、E和F组，每组10只鼠(10只眼)。采用角膜微囊袋法制作角膜新生血管模型，其中A、B、C、D及E组除植入明胶海绵+琼脂糖胶丸外分别再加入碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)(50ng／ul)、netrin-1(100ug／ml)、bFGF+netrin-1(100ug／ml)、netrin-1(5000ug／ml)、bFGF+netrin-1(5000ug／ml)，对照组(F组)只含明胶海绵+琼脂糖胶丸。植入药丸后每日裂隙灯显微镜下观察CNV的生长情况，并照相分析。在造模后7d和21d每组各处死5只鼠，取全角膜作病理学分析。对于b-FGF诱导的大鼠角膜新生血管模型，采用实时荧光定量PCR法检测新生血管化角膜与正常角膜中UNC5A、UNC5B、UNC5C、UNC5D、DCC及neogenin共6种netrin-1已知所有受体表达情况。结果1．体外实验：Netrin-1浓度低于500ng／ml时，促进HUVECs的增殖和迁移；而netrin-1浓度在1000 ng／ml-5000ng／ml时，抑制HUVECs的增殖和迁移。其中netrin-1为50ng／ml时，HUVECs的增殖能力最强；netrin-1浓度为100ng／ml时，HUVECs的迁移能力最强。体外微血管模型显示在浓度低于500ng／ml时，netrin-1对于血管腔形成没有影响，而当浓度为1000ng／ml-5000ng／ml时，netrin-1抑制血管腔的形成，且抑制作用呈剂量依赖性。HUNECs中netrin-1受体家族只有UNC5B一种受体表达。经酶切和测序鉴定，本课题构建了UNC5B特异性shRNA的重组质粒，并成功转染HUVECs。UNC5B干扰组HUVECs的增殖能力比对照组增强(P＜0.05)。UNC5B干扰组netrin-1使HUVECs的增殖与迁移能力增强，而不表现出抑制作用。体外血管模型中，靶向干扰UNC5B基因后，无论netrin-1浓度多少，其对血管腔的抑制作用均消失。2．体内实验：角膜微囊袋法新生血管模型显示实验组A在4d左右可见新生血管从角膜缘向植入物成束局限生长，7d左右达到高峰，3周左右完全消退。7 d时各组新生血管面积比较，B组面积与A组相近，差异无统计学意义(P＞0.05)。C组显著高于A、B组，差异有统计学意义(P＜0.05)。D、E、F组显著低于A组，差异有统计学意义(P＜0.05)。大鼠角膜中netrin-1受体家族中只有UNC5B和Neogenin两种受体表达，其中正常角膜中UNC5B的表达低于Neogenin。新生血管化角膜中UNC5B的表达高于Neogenin。结论Netrin-1对体外微血管管腔形成具有促进和抑制的双重调控作用，表现为低浓度促进而高浓度抑制。HUVECs中netrin-1受体家族只有UNC5B一种受体表达。RNA干扰实验显示UNC5B在导向血管生长中是一种抑制性受体，沉默UNC5B基因后促进HUVECs增值与迁移。netrin-1对大鼠角膜血管新生呈双重作用，表现为低浓度的netrin-1能促进新生血管形成，而高浓度的netrin-1则抑制新生血管形成。大鼠角膜内netrin-1受体家族有UNC5B和neogenin两种受体表达。其中正常角膜内UNC5B的表达低于neogenin，新生血管化角膜中UNC5B的表达高于neogenin。