背景：肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KP)是一种革兰阴性杆菌。该菌在自然界分布广泛，是一种重要的条件致病菌，常常引发社区获得性感染和医院内感染。近年来，在常见的革兰阴性菌感染病例中，肺炎克雷伯菌已成为了仅次于大肠杆菌的重要条件致病菌，引起的感染类型主要包括败血症、泌尿系统感染和呼吸道感染。各种引起患者机体免疫力下降的因素都可以导致肺炎克雷伯菌感染，包括对激素药物、免疫抑制剂和抗代谢药物的使用，患者自身患有基础性疾病和采用侵入性的手术治疗方式。并且，肺炎克雷伯菌可通过病人之间、病人与医护人员和医疗用具的相互接触而发生感染。为了更好的预防和治疗由肺炎克雷伯菌引起的感染，有必要对它的致病机制进行深入的研究。生物膜的形成使得肺炎克雷伯菌能够长期地适应并生存在宿主环境中，从而免于被血清因子杀灭和吞噬而传播广泛。cAMP受体蛋白（cyclic AMP receptor protein, CRP)可与cAMP相结合而影响着众多毒力基因的表达,其中包括参与肺炎克雷伯菌生物膜形成相关基因的转录表达过程。因此，推测肺炎克雷伯菌crp基因的缺失可能也会影响菌体的生物膜形成能力，继而影响该菌的毒力及致病性。目的：建立一种可行的肺炎克雷伯菌基因无痕敲除方法，为在分子水平上进一步了解该菌毒力和致病性相关靶基因的调节机制奠定基础。另外，验证突变株的表型与CRP基因缺失的对应关系，分析回补株的表型能否回复到野生株的状态。方法：1.首先利用无痕敲除的方法构建突变株。依据肺炎克雷伯菌NTUH-K2044的基因组序列，设计用于扩增crp基因两侧同源臂的引物，PCR扩增得到两侧同源片段，用融合PCR的方法得到同源臂融合片段，酶切后克隆到自杀质粒pKO3-km中，得到重组质粒pKO3-km-crp。利用同源重组的方法，得到crp基因缺失的突变株Δcrp。2.回补株的构建。PCR扩增得到crp基因片段，酶切处理后的crp片段克隆到载体pGEM-T-easy-km上，构建得到回补质粒pGEM-T-easy-km-crp。将回补质粒转入突变株Δcrp中，得到回补株C-Δcrp。3.生物膜表型的测定。用结晶紫染色法分别测定突变株，回补株和野生株的生物膜形成量，计算出它们各自的均值和标准差。结果：建立了一种肺炎克雷伯菌无痕敲除的方法，并成功构建了肺炎克雷伯菌突变株crp，突变株基因组内无任何抗性筛选标记残留。利用质粒pGEM-T-easy-km构建得到回补质粒，经测序正确后，转入突变株中，获得回补株C-Δcrp。对野生株、突变株和回补株的生物膜形成能力进行测定，结果表明突变株的生物膜形成量少于回补株和野生株，且回补株能够部分回复突变株的生物膜形成能力。结论：crp基因缺失可以减弱肺炎克雷伯菌的生物膜形成能力，表明crp可能参与正向调控肺炎克雷伯菌生物膜形成相关基因的转录表达，从而影响肺炎克雷伯菌生物膜形成。回补株C-Δcrp的生物膜表型可以部分回复到野生株的状态，表明crp基因与肺炎克雷伯菌的生物膜形成具有一一对应的关系，从而为进一步研究crp基因影响肺炎克雷伯菌生物膜的形成机制提供可能。