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前言膜连蛋白家族成员与不同种类肿瘤的发生发展关系密切,并且参与肿瘤细胞生长和分化等调节机制。膜连蛋白A2(Annexin A2)是膜连蛋白家族中的一员,是一种钙依赖性磷脂结合蛋白,有一个短的决定其生物学特性的疏水N-端结构域和一个参与磷脂结合的核心区。Annexin A2参与了多种生物学活动,包括信号转导、细胞迁移、DNA合成、细胞增殖和凋亡等。近来多项研究表明,Annexin A2在多种肿瘤中表达失调,且其表达水平和肿瘤的发生、浸润、转移、临床分期和愈后密切相关。目前在非小细胞肺癌中关于Annexin A2对侵袭和转移的影响研究有限。本研究旨在探讨Annexin A2在非小细胞肺癌中的表达情况及其对体外培养肺癌细胞侵袭和转移的影响。材料与方法1、材料与试剂120例原发性肺鳞癌、腺癌石蜡包埋标本,来自2000年-2005年中国医科大学附属第一医院手术切除的原发性肺癌组织。人正常支气管上皮细胞HBE,人肺巨细胞癌细胞系BE1(高侵袭能力亚型)、LH7(低侵袭能力亚型);肺腺癌细胞系A549、A2(人肺腺癌细胞系低转移系)、LTEP-a-2(LTE)和SPC-A-1(SPC)。鼠抗人Annexin A2单克隆抗体(sc-28385)购自Santa Cruz公司,S-P超敏试剂盒(Kit-9701)购自福州迈新生物技术开发公司,兔抗人多克隆anti-β-actin抗体(sc-1616)购自中山生物技术有限公司,辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(ZB-2305)、羊抗兔二抗(ZB-2301)购于北京中杉金桥生物技术有限公司。Annexin A2 siRNA(sc-29199)购自Santa Cruz公司,转染试剂lipofectamine 2000 reagent购自Invitrogen公司。2、实验方法(1)细胞培养(2)免疫组织化学(S-P)法标本经中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,4μm厚连续切片,采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法(S-P),进行免疫组化染色。DAB显色。用PBS代替一抗作为阴性对照。(3)肺癌细胞系的免疫化学染色(S-P)法细胞爬片后加入固定液固定,采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法(S-P),进行免疫组化染色。DAB显色,棕褐色反应产物代表抗原定位。用PBS代替一抗作为阴性对照。(4) Western blot提取细胞蛋白,采用卡玛斯亮蓝法进行蛋白定量。取等量蛋白,进行SDS-PAGE凝胶电泳、转印,一抗(anti-Annexin A2 1:300稀释,anti-β-actinl:500稀释),辣根过氧化物酶标记二抗(1:1500稀释)室温孵育,ECL发光,结果经自动电泳凝胶成像分析仪(ChemiImager 5500,Alpha Innotech,USA)成像,FluorChen V2.0系统采集数据。以β-actin为内对照。实验重复3次,取算术平均值进行统计分析。(5) SiRNA转染传代细胞LTE在培养瓶中生长2天后,传至六孔板,3μl Annexin A2 SiRNA与6μl Lip2000分别与100μl无双抗无血清培养基混合后将Annexin A2 SiRNA与Lip2000溶液混合,再以1:5的比例与无双抗无血清培养基混合,用无双抗无血清培养基将细胞洗两次并将混合液加入孔板。转染后6h加入等体积含双倍血清的培养基,24h后换正常培养基,培养3天后收集细胞,进行检测。(6)细胞划痕实验Annexin A2 SiRNA瞬时转染后第3天,在约100%融合的单层细胞表面用高压灭菌的白色枪头做线性划痕,尽量垂至于背后的横线划痕,未转染细胞划痕为阴性对照。划痕处分别在0h、12h和24h使用光学显微镜(BX60,OLYMPUS)观察成像,沿划痕测量10处宽度取平均值。(7)统计学分析应用SPSS13.0统计软件进行数据处理,P＜0.05为差异有显著性。结果1、癌旁正常肺支气管上皮细胞仅见纤毛Annexin A2表达;肺鳞癌和肺腺癌组织标本中AnnexinA2与分化程度、临床分期、淋巴结转移相关:2、Annexin A2在肺癌细胞系表达并不一致,巨细胞癌细胞系中相对较高,而腺癌细胞系中表达较低;3、HBE中Annexin A2在细胞核和胞浆表达,以细胞核表达为主;在LTE细胞中Annexin A2在细胞浆和细胞核表达;在BE1细胞中Annexin A2在细胞膜和细胞浆表达;4、瞬时转染Annexin A2 SiRNA后肺癌细胞生长缓慢,细胞迁移和增殖能力明显减弱。结论Annexin A2的高表达与肺癌恶性程度及侵袭转移相关,在非小细胞肺癌细胞系中选择性表达并促进肺癌细胞的侵袭和转移。