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研究以同源不同倍性西瓜为试材,首先利用酶解法对西瓜叶片原生质体的制备条件进行优化,再用不同温度处理不同倍性西瓜叶片原生质体,通过测定原生质体细胞膜的导水系数变化评价细胞膜稳定性;利用荧光探针结合显微技术测定细胞内Ca2+浓度变化,利用间接和直接荧光免疫显微观察细胞微管与微丝的结构变化,最终从细胞水平探讨不同倍性西瓜在不同温度胁迫下的可能抗性形成机制。主要结果如下:(1)制备西瓜叶片原生质体的最佳条件为:2.7%纤维素酶+0.78%离析酶溶于0.4mol/L甘露醇中,80rpm,酶解120min;(2)测定不同温度下,不同倍性西瓜细胞膜导水系数的变化发现:在15℃与20℃的低温处理下,二倍体细胞膜导水系数的增幅极显著小于四倍体,但在30℃-40℃的高温处理下,结果相反。说明二倍体在低温胁迫下,细胞膜稳定性好,即抗冷性强,但在高温胁迫下,四倍体细胞膜稳定性好,比二倍体更抗热;(3)西瓜叶片原生质体Ca2+荧光探针成功装载的最佳方案为:10μmol/L荧光染料,室温25℃,黑暗放置2h;(4)通过测定不同缓冲液下原生质体荧光强度,获知:低温5℃处理下,细胞内Ca2+浓度升高,且大部分Ca2+从胞外运输进入细胞内;(5)通过比较不同倍性西瓜原生质体在不同温度处理下的荧光变化特点发现:低温15℃~20℃处理下,二倍体细胞内Ca2+变化比四倍体稳定,但在高温30℃-40℃处理下,结果相反。说明细胞内的Ca2+变化与西瓜本身抗性有关:抗性强,细胞膜稳定性好,胞内Ca2+变化越稳定,反之,细胞膜稳定性差,胞内Ca2+变化极不稳定;(6)确定西瓜叶片微管染色最佳方案为:3.7%Paraformaldehyde+1%glycerol+2%TritonX-100,固定1.5h,酶解15min;测定不同倍性西瓜不同温度处理下微管的动态变化发现:二倍体在低温15℃处理30min后,微管解聚速度大于四倍体,高温40℃处理下,结果相反;但随着处理时间延长,二者叶片微管的解聚都较严重。说明微管参与了温度胁迫,短时间的胁迫下,微管的快速解聚和抗性相关;(7)确定西瓜悬浮细胞微丝染色最佳方案为:将细胞置于1.85%Paraformaldehyde+1%glycerol+2%TritonX-100固定液中,固定1.5h,酶解5min;经温度胁迫处理30min后发现:微丝与微管类似,都是通过自身结构的动态改变适应外界环境,但同一温度处理下,微丝解聚要比微管显著。总之,细胞膜、胞内Ca2+浓度及细胞骨架之间存在紧密联系。短时间的温度胁迫,抗性强的西瓜,细胞膜稳定性强,微管也表现出快速解聚与重组,胞内Ca2+浓度波动小;反之,微丝微管都严重解聚,导致细胞膜遭到破坏,胞内Ca2+外渗,最终使细胞瓦解。