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犬子宫蓄脓(canine pyometra)是母犬发情后期发病率最高的产科疾病。已有研究表明,子宫内膜囊性增生(CEH)是本病的原发性疾病,在细菌感染和其它因素的共同作用下,最终发展为犬子宫蓄脓。在犬子宫内膜的病理变化中,雌激素(E2)和孕酮(P4)是诱发囊性增生的主要因素。本研究的主要目的是建立一个犬子宫内膜基质细胞的培养模型,探讨孕酮受体(PR)在犬子宫内膜基质细胞中的表达,并测定E2和P4对细胞增殖和PR表达的影响,以期有助于阐明E2和P4与犬子宫蓄脓发病机理的关系,为研究犬子宫蓄脓病的病因提供依据。1.选用酶消化法分离犬子宫内膜基质细胞(ESCs),经过原代培养、细胞鉴定、传代培养、消化方式的探索、血清依赖性的探索,观察犬ESCs体外培养的生长特性,探索该细胞的分离和培养的最佳方法。结果表明:37℃条件下,0.125%的胶原酶I消化3~4 h消化效果最好,易于单个细胞易分离。高浓度(20%)胎牛血清适合犬ESCs的生长。细胞呈长梭形或多角形,细胞核呈卵圆形。接种后5~6 d可长成单层,细胞间存在重叠生长现象。利用免疫组织化学染色法鉴定细胞,两种形态的细胞均表达波形蛋白,阳性率可达90%以上,角蛋白阴性,证明所得到的细胞为子宫内膜基质细胞。2.使用MTT法检测E2和P4对犬ESCs增殖的影响。结果表明,血清饥饿1 d后,无激素刺激组的细胞从第2 d开始生长速度加快,进入对数生长期,持续时间约为5 d。第6d进入平台期,随后开始脱落。第7 d~8 d细胞数量减少速度较慢。血清饥饿1 d后添加不同浓度的E2(15、30、100 pg/mL)细胞生长曲线类似于对照组。血清饥饿1 d后添加不同浓度的P4(3、15、30 ng/m L)细胞生长速度增快,平台期细胞数量增多。在细胞生长周期的三个阶段(d3:指数期,d6:平台期,d8:衰亡期),E2对ESCs的增殖无典型影响,在相同阶段,ESCs的增殖对E2浓度变化(15、30、100 pg/m L)不敏感。P4(15、30 ng/m L)对ESCs的增殖有显著的促进作用(P<0.05),在同一阶段,ESCs的增殖与P4浓度变化呈正相关。3.通过细胞免疫组织化学染色的方法检测E2和P4对犬ECSs中孕酮受体表达的影响。结果显示体外培养的犬ESCs对PR抗体呈强阳性,细胞核呈棕黄色,细胞质内基本不含受体阳性物质,说明PR主要在细胞核内表达。对照组中PR的阳性率在整个培养过程中始终大于90%。培养液中添加E2(15、30、100 pg/mL)后PR的阳性率与对照组比没有显著变化。培养液中添加P4(3、15、30 ng/mL)后,第6 d起对ESCs中PR的阳性率有显著的抑制作用(P<0.05),低浓度P4组(3 ng/m L)抑制程度随着作用时间延长而增强,在第8 d阳性率最低。高浓度P4组(15、30 ng/mL)阳性率第8 d与第6 d比下降不明显。低浓度P4组(3 ng/mL)第6 d、8 d的PR阳性率均低于高浓度P4组(15、30ng/m L)。以上研究表明,P4对体外培养的犬ESCs的增殖有促进作用。P4对PR的表达有抑制作用,且抑制强弱与P4浓度和作用时间有关。说明P4对PR表达可以在细胞水平进行调控。E2对犬ESCs的调节作用不显著。