治疗移植排斥的理想方法是诱导抗原特异性免疫耐受,因为后者不会损害宿主的整体免疫功能,极大降低移植排斥治疗中感染等疾病的发生率。纳米技术的发展,极大促进了抗原特异性免疫耐受诱导技术的提高。已有研究者开发出可以靶向杀伤同种抗原特异性T、B淋巴细胞和抗原提呈细胞的纳米颗粒,并在诱导移植耐受中得到有效证实。纳米仿生颗粒在世界范围内被认为是自身免疫性疾病和同种异体移植排斥反应的有效免疫调节剂,但目前大多数纳米仿生颗粒的设计思路主要集中在包裹缓释可溶性抗原、毒素或细胞因子,并让细胞通过吞噬或胞饮作用吞噬纳米粒子进而诱导致耐受性抗原提呈细胞如调节性DC,再通过后者诱导抗原特异性T细胞凋亡或抑制,很少有研究关注仿生纳米颗粒与抗原特异性T细胞的直接接触。而且以往研究中,仿生纳米颗粒所负载的调节分子种类较少,多种免疫调节分子的联合递送很少见。研究目的:本研究制备聚乳酸-羟基乙酸纳米粒（PLGA-NPs）并在其表面共价偶联同种靶向抗原H-2Kb-Ig二聚体、负调节分子抗-Fas单抗、PD-L1-Fc和TGF-β以及抗吞噬分子CD47-Fc,研制可生物降解的、能直接靶向结合同种反应性T细胞的、多效能的杀伤性PLGA纳米粒,进而探索其在小鼠同种异体皮肤移植模型中治疗皮肤移植排斥的疗效,作用机制以及可能引发的毒副作用等。研究方法及结果:1、PLGA纳米粒的制备及表征:采用复乳溶剂挥发法制备了两种规格的PLGA纳米粒。扫描电子显微镜（SEM）观察纳米粒的形状和大小,激光粒度检测仪分析纳米粒的直径分布,Zeta电位仪检测其表面的zeta电位。结果显示,所制备的两种规格的PLGA纳米粒均呈规则圆形,表面光滑,其粒径分别为202.4nm和78.8 nm（分别称为200nm和80 nm粒子）,平均Zeta电位分别为-3.09mv和-8.63mv。而后,通过改良的EDC/NHS化学法将聚乙烯亚胺（PEI）结合于纳米颗粒表面,使其表面功能化,布满-NH2+基团,从而能够共价偶联蛋白分子。2、杀伤性PLGA纳米粒的制备及表型分析:在PEI修饰的PLGA纳米粒表面偶联BSA,用Micro BCA微量蛋白定量试剂盒分析PLGA纳米粒表面的最大蛋白负载量。结果显示,1 mg的直径200 nm和80 nm粒子表面的最μμ大蛋白吸附量分别为75.31μg和77.51μg。以此为基础,在表面功能化的PLGA纳米粒表面联合吸附H-2Kb-Ig二聚体、抗-Fas单抗、PD-L1-Fc、TGF-β和CD47-Fc等5种免疫分子,制备多效能靶向杀伤性PLGA纳米粒。通过相应的荧光单抗染色和激光共聚焦显微镜观察显示,H-2Kb-Ig二聚体、抗-Fas单抗、PD-L1-Fc和CD47-Fc四种分子均成功吸附于PLGA纳米粒表面。因为没有相应的荧光标记的抗TGF-β单抗,所以TGF-β的表面负载没有检测。3、小鼠同种皮肤移植模型的建立和杀伤性PLGA纳米粒的体内治疗:7-8周龄的雄性C57BL/6小鼠（H-2Kb）作为皮肤供者,H-2Kb基因突变的C57BL/6小鼠(bm1鼠,H-2Kbm1)作为皮肤受者,建立同种异体皮肤移植模型。在皮肤移植后第9、11和13天,将直径200 nm的杀伤性PLGA纳米粒经尾静脉输注治疗三次,同时设立7种对照PLGA纳米粒治疗组。每天观察皮肤移植物存活状态,第15天时通过免疫荧光法检测受者皮肤移植物中同种反应T细胞、CD4+和CD8+T细胞的浸润程度。结果显示,杀伤性PLGA纳米粒能强有力地抑制移植排斥,延长皮肤移植物存活期达45天（MST 61天）,其他对照组(PBS、Blank NPs、NPaFas、NPKb、NPCD47、NPKb/aFasb/aFas and NPKb/aFas/PD-L1/TGFβ等)的MST则分别为16、19、22、27、27、36和41天。第15天,H-2Kb-Ig二聚体的原位荧光染色显示,皮肤移植中浸润的H-2Kb同种抗原反应性T细胞减少79.8%;单抗荧光染色显示,皮肤移植物中浸润的CD8+T细胞和CD4+T细胞分别减少了48.9%和36.4%;HE染色显示炎性细胞的浸润也明显减少。另外,直径80 nm的杀伤性PLGA纳米粒的治疗仅使皮肤移植物的存活期延长了22天,效果明显弱于200 nm的杀伤性PLGA纳米粒,因此后续研究中只关注200 nm的杀伤性PLGA纳米粒。4、杀伤性PLGA纳米粒的体内作用机制:第三次治疗后的2天（第15天）,H-2Kb-Ig二聚体染色和流式分析显示,杀伤性PLGA纳米粒（Killer NPs）治疗组移植鼠脾脏淋巴细胞群中,H-2Kb特异性同种反应CD8+T细胞的频率下降了90.3%,对照组CD47-killer NPs(NPKb/aFas/PD-L1/TGFβ)and Anti-Fas-killer NPs(NPKb/PD-L1/TGFβ/CD47)分别下降了62.6%和51.9%,而无关同种抗原靶向的对照组（H-2Kd killer NPs）只下降了12.6%。在外周血中,80.7%的H-2Kb特异性同种反应CD8+T细胞被Killer NPs治疗所清除;同时,Killer NPs治疗导致移植鼠脾脏中CD8+T细胞的凋亡率增高3倍,CD47-killer NPs和Anti-Fas-killer NPs对照组分别增高113.5%和48.2%,而H-2Kd killer NPs对照组只有轻微增高。外周血中的情况与此相似;Killer NPs治疗还使移植鼠脾脏活化状态的CD8+T细胞频率下降了67.8%,使受者T细胞在体外与供者脾细胞混合培养中的同种增殖能力降低了50%;另外,Killer NPs治疗还导致移植鼠脾脏和淋巴结中CD4+/CD25+/Foxp3+的调节性T细胞频率分别升高了81.7%和80.1%。5、杀伤性PLGA纳米粒的体内示踪、组织分布和与免疫细胞的接触:ICG标记的杀伤性PLGA纳米粒经尾静脉输注皮肤移植鼠,利用小动物活体远红外成像仪在不同时间点观察纳米粒的体内运行规律,另在2 h时取移植鼠各器官进行离体器官成像。结果显示,Killer NPs可通过血液系统分布于脾脏、淋巴结、肝、肾、肺、心脏和皮肤移植物局部,荧光强度在30 min至4 h间最强,体内滞留时间可达30 h以上。同时,H-2Kb-killer NPs（non-targeting killer NPs）,CD47-killer NPs和Blank NPs等对照纳米粒的体内运行和组织分布与Killer NPs呈现部分差异,且体内滞留时长明显缩短,分别为24 h,24 h和18 h。利用PE标记的Killer NPs经尾静脉输注皮肤移植鼠,流式分析也显示Killer NPs在外周血、脾脏和淋巴结中存在一定的频率;荧光单抗染色和激光共聚焦显微镜观察显示,移植鼠脾脏组织切片中,大量Killer NPs累积于红髓和边缘区,与CD8+T细胞有较多的荧光共定位,而与CD4+T细胞、B细胞、单核细胞和DC细胞接触较少。相比较而言,CD47-killer NPs在红髓和边缘区分布较少,而与上述除B细胞外的诸多免疫细胞呈明显增多的荧光共定位。这些结果提示:在H-2Kb-Ig靶向抗原的引导下,killer NPs在体内可以与CD8+T细胞直接接触,并且在CD47-Fc分子保护下被巨噬细胞和DC细胞吞噬的现象较少。6、杀伤性PLGA纳米粒治疗对机体整体免疫功能的影响和毒副作用:在killer NPs第三次治疗后2天,流式分析显示移植鼠脾细胞群中CD3+T细胞、CD4+T细胞、B细胞和NK细胞的频率未明显下降;混合淋巴细胞培养实验显示受者T细胞对第三方脾细胞的同种增殖能力没有明显下降;细胞毒实验显示NK细胞对肿瘤细胞的非特异性杀伤活性也没有下降;移植鼠载瘤实验显示killer NPs治疗并未显著降低治疗鼠的整体抗肿瘤能力。在killer NPs末次治疗后第2、17和32天,移植鼠血常规检测显示外周血中8种细胞群的数量或比例未有明显下降;生化指标分析显示肝功能和肾功能也未受明显损伤;各器官组织切片的HE染色结果显示移植鼠的脾、肾、肝、心和肺等重要脏器未见明显病理损伤。这些结果初步提示:killer NPs的体内治疗未导致移植鼠其他免疫细胞种群的明显的非特异性杀伤,未导致移植鼠整体免疫功能的明显下降和主要脏器的可见的毒副作用。结论:在PLGA纳米粒表面负载靶向抗原、多种负免疫调节分子和抗吞噬分子,成功制备直径200nm的、可生物降解的、多效能的杀伤性PLGA纳米粒。其经血液循环分布于同种皮肤移植鼠体内多种组织器官,在淋巴器官与同种抗原反应性CD8+T细胞直接接触,诱导其凋亡、抑制其活化和同种增殖能力,促使调节性T细胞增殖,导致移植鼠体内大多数同种抗原反应性CD8+T细胞被选择性清除,移植物局部浸润大幅减少,从而有效抑制皮肤移植排斥,大幅延长移植物存活期,同时对机体其他免疫细胞、整体免疫功能和主要脏器未见明显的毒副作用。本研究为同种异体移植排斥的特异性免疫疗法提供了新的策略和思路。