异戊二烯(C5H8)是一种重要的C5平台化合物,是萜类化合物的基本组成单元。作为重要的化工原料,可用于合成与天然橡胶性能非常接近的生物橡胶。此外,异戊二烯还可应用于合成各种萜类化合物,广泛应用于农药、医药、香料及粘结剂等领域。随着石油资源的日益枯竭,发展不依赖石油资源的生物基C5平台化学品已成为实现经济社会可持续发展的战略需求。自然界中,异戊二烯和萜类化合物都采用了相类似的合成途径。即-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径(MEP pathway)和甲羟戊酸代谢途径(Mevalonate pathway,MVA pathway)。本研究通过在大肠杆菌中引入外源MVA途径,成功的构建了产异戊二烯工程菌,并通过合成生物学和代谢工程手段对MVA途径进行优化,为异戊二烯的大规模生物合成提供了基础。主要研究内容如下:1.异戊二烯产量气相检测方法的建立以异戊二烯标准品作为定量标准。系统采用Agilent Techbologies 7890A GC system型气相色谱仪,色谱柱为HP-55%phenyl methyl siloxan(30 m×320μm×0.25μm),检测器为火焰离子化检测器;气化室温度50℃,柱箱温度240℃,检测器温度280℃。得到了异戊二烯产量与检测峰面积的标准曲线。2.不同物种异戊二烯合成酶的克隆表达从蒙古栎、斛栎、麻栎、辽东栎、夏橡以及杨树的基因组中克隆出异戊二烯合成酶基因构建了到表达载体p BAD-His B中,分别与p YESs和p SPMIc共转化到E.coli BW25113得到重组菌,通过自诱导表达目的蛋白得到成功表达,其中BW-01菌的异戊二烯的产量为451.4 mg/L。3.表达载体的优化对于异戊二烯产量的提高对重组菌内的三个表达载体分别采用增加稀有密码子AGA、使用不动强度启动子以及改变表达载体拷贝数等方式调控关键基因在宿主菌内的表达,从而改变重组菌株产异戊二烯的能力,最优的菌株BW-12异戊二烯产量达到了1341.6 mg/L,比未优化前提高了197.2%。4.遗传背景的改造对于异戊二烯产量的提高以λ-Red重组技术为基础将一部分表达基因整合到宿主菌的基因组中,同时敲除了宿主菌基因组中不必要基因,获得的新的产异戊二烯菌株BW-13,检测到的异戊二烯产量最高达到1267.3 mg/L,诱导后生物量提高了60%。本研究以大肠杆菌为表达宿主,通过将外源的MVA代谢途径构建到表达载体并转入宿主,使重组后的菌株产异戊二烯。并以整个重组系统为出发点,通过优化使整个重组系统内各蛋白质的表达量处于相对平衡状态,进而使重组的系统功能最大化,显著提高了大肠杆菌萜类化合物合成前体途径,同时提高了菌株产异戊二烯的能力。本研究构建并优化的MVA途径还可用于其他萜类化合物的合成,为今后生物合成领域的研究提供良好的借鉴。