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本室前期从米黑根毛霉中克隆得到一种1,3-位置专一性的脂肪酶基因并将其在毕赤酵母GS115中成功表达,该酶命名为RML。RML在催化甲酯化豆油制备生物柴油的过程中展现了很强的位置专一性,但其异源表达水平较低,不能满足工业化应用的需求。本研究的目标是异源高效表达RML并将其应用到微藻生物柴油的制备工艺中。通过更换表达体系、增加目的基因前导肽、优化载体上信号肽密码子及增加目的基因拷贝数等策略,构建了多种不同类型的重组质粒并分别将其电转化到毕赤酵母X-33中。摇瓶发酵筛选得到一株含有两个拷贝目的基因的重组菌株,其胞外酶活为1200 U/mL,提高到原来的21.4倍,将该重组菌株表达的酶命名为Lipase GH2。发现前导肽的增加使Lipase GH2蛋白糖基化并提高了其对温度、甲醇及乙醇的耐受性。经检测发现Lipase GH2以发酵液的形式在4℃可稳定存在6个月以上。RT-qPCR探讨了酶活提高的原因是:1)目的基因转录水平增加;2)没有对宿主内质网产生蛋白折叠压力。实验发现,当在含有4个拷贝目的基因的重组菌株中过表达二硫键合成酶基因PDI时,可以缓解内质网中蛋白折叠的压力,使该重组菌株胞外酶活提高到原来的1.3倍,达到 1430 U/mL。在正己烷体系中,尝试将Lipase GH2以液体酶的形式直接应用到催化微藻油与甲醇或乙醇的酯化反应中。确立了以甲醇:氯仿(2:1,v/v)为萃取剂对小球藻藻粉提取微藻油的方法,并用薄层层析和气相色谱对提取的微藻油的脂肪酸构成进行分析,发现主要的脂肪酸种类为月桂酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸。LipaseGH2单独使用即可达到与以往组合酶作用相同的转化效果。本实验优化了游离酶Lipase GH2催化微藻生物柴油的制备工艺,包括:反应温度、含水量、醇油摩尔比、醇的添加策略、酶量及酶的重复使用次数。反应24 h,两种类型的生物柴油脂肪酸甲酯(FAME)和脂肪酸乙酯(FAEE)的最高转化率均超过90%,且在FAME的制备过程中,Lipase GH2可以重复使用5次以上。比较并建立了制备FAME和FAEE的工艺条件,结果证明LipaseGH2可以高效、低成本的应用到制备微藻生物柴油的工艺中。另外,本室前期将一种来源于圆弧青霉的新型单双酰脂肪酶在毕赤酵母GS115中表达,该酶命名为LipaseGH1。本研究从影响异源蛋白表达的外部环境条件入手,针对细胞生长与产酶最适pH之间的矛盾,通过转换pH策略,用比BMGY/BMMY培养基成本低6倍的BSM-Na2GP培养基在7.5-L自动发酵罐上成功实现了该菌株的高密度发酵,最高酶活可达18000 U/mL,蛋白产量最高可达3.94 g/L。并发现Lipase GH1为糖基化蛋白且非常稳定,其发酵液在4℃可稳定保存6个月以上。将LipaseGH1首次应用到食品乳化剂甘油单酯(MAGs)和甘油双酯(DAGs)的制备过程中,在以甘油:油酸摩尔比为11:1、含水量1.5 wt%、酶量80 U/g,35℃下反应24 h时,转化率可达84%。与来源于干酪青霉(Penicillum cameberti)的商业化单双酰脂肪酶Lipase G50的催化效果进行比较,Lipase GH1的催化合成MAGs and DAGs的反应速率是Lipase G50的两倍,证明Lipase GH1在食品乳化剂方面具有显著的开发价值。