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目的利用RNA干扰(RNAi)技术,使用特异的靶向于HIF-1基因的小干扰RNA(siRNA)作用于表达HIF-1阳性的宫颈癌细胞株SiHa,以了解siRNA对HIF-1基因的特异性抑制作用,为使用RNAi技术治疗宫颈癌的可行性提供实验基础。方法1.分别构建针对HIF-1基因的四个siRNA H1、H2、H3、H4以及阴性对照(NegativeControl)和阳性对照(Human GAPDH)siRNA,鉴定无误后均借脂质体转染宫颈癌细胞株SiHa。使用带GFP荧光标记的siRNA,优化转染条件,测得转染效率。2.用靶向于GAPDH的siRNA作为阳性对照,分别检测常氧和低氧条件下培养的各组细胞在转染后48h GAPDH的mRNA表达情况。3.RT-PCR和Western Blotting方法检测转染前后常氧和低氧培养的SiHa细胞中mRNA和蛋白的表达变化,筛选出抑制率最高的siRNA。4.将筛选出的siRNA转染SiHa细胞,RT-PCR和Western Blotting方法检测转染前后常氧和低氧培养的SiHa细胞中24、48、72及96小时mRNA和蛋白的表达变化,验证RNAi作用的时效性及特异性。结果1.荧光倒置显微镜照片显示,SiHa细胞在常氧和低氧条件下,均在siRNA终浓度为30nM时荧光最强,说明此时siRNA进入细胞较多,转染效率最高,可达到80%以上。2.以β-actin作为内参,常氧及低氧培养时β-actin组β-actin mRNA的表达均无明显变化,GAPDH组中GA-GA组的GAPDH mRNA的表达均比空白-GA及NC-GA组明显下降(p＜0.05)。3.在本实验中,转染后RT-PCR和Western Blotting结果提示:针对HIF-1构建的四个siRNA对HIF-1基因的干扰效率不同,其中H2siRNA引起常氧和低氧培养的SiHa细胞中HIF-1表达水平的下降最显著(P＜0.05),根据试验结果,选择对HIF-1抑制率最高的H2siRNA进行下一步实验。4.将H2siRNA转染常氧和低氧培养的SiHa细胞,均引起靶基因特异、高效性抑制,转染后24h、48h、72h及96h均可观察到HIF-1基因的显著性降低,均以48h时下降最显著(P＜0.05)。可见抑制作用至少维持到转染后96h,对对应的非靶基因无明显抑制作用。结论HIF-1siRNA可通过靶向性抑制HIF-1基因mRNA和蛋白水平的表达,从而抑制宫颈癌细胞SiHa的增殖生长。本实验为进一步阐明HIF-1的功能、针对HIF-1基因治疗的靶向调控提供了实验依据。RNA干扰技术可望成为宫颈癌的一种新的基因治疗方法。