第一部分血维生素D与上尿路结石的相关性:系统评价与荟萃分析背景和目的:当前有众多研究比较了结石和非结石患者血清/血浆1,25(OH)2D3和25(OH)D水平,但是它们的结果并不一致,甚至相互矛盾。因而我们开展了这项研究以便系统地比较结石和非结石患者血维生素D水平的差异。方法:系统检索PubMed,Web of Science,Cochrane图书馆,中国知网和万方数据库,筛选纳入文献,并进行Meta分析。结果:最终本研究共纳入包含有23228名参与者的32项研究。Meta分析结果表明,相较于非结石对照者,结石患者和含钙结石患者血1,25(OH)2D3水平显著升高(加权均数差 WMD,10.19pg/ml;95%CI,4.31-16.07;p=0.0007 和 WMD,11.28pg/ml;95%CI,4.07-18.50;p=0.002),但血 25(OH)D 水平相近(WMD,0.88ng/ml;95%CI,-1.04-2.80;p=0.37 WMD,-0.63ng/ml;95%CI,-2.72-1.47;p=0.56)。与对照组和尿钙正常结石患者相比,高钙尿结石患者血1,25(OH)2D3升高(WMD,9.41 pg/ml;95%CI,0.15-18.67;p=0.05 and WMD,2.75pg/ml;95%CI,-0.20-5.69;p=0.07)并伴随 25(OH)D 血浓度升高(WMD,5.02ng/ml;95%CI,0.99-9.06;p=0.01 和 WMD,5.02ng/ml;95%CI,2.14-7.90;p=0.0006)。与非结石患者相比,尿钙正常结石患者血1,25(OH)2D3水平升高(WMD,6.85pg/ml;95%CI,-5.00-18.71;p=0.26)但无统计学差异,且两者血25(OH)D浓度相近(WMD,0.94ng/ml;95%CI,-3.55-5.43;p=0.68)。进一步行敏感性分析得出与上述结果相似的结果。结论:目前的证据表明血1,25(OH)2D3增加与泌尿结石相关,而血25(OH)D升高仅与高钙尿结石显著相关。尚需进一步研究确认上述结果并阐明维生素D在结石发病机制中的作用。第二部分基于维生素D通路激活构建高钙尿结石大鼠模型背景和目的:目前结石动物模型以高草酸尿动物模型为主,高钙尿结石动物模型较少。经典的遗传性高钙尿结石大鼠模型和一些可形成肾间质钙化的基因敲除小鼠存在培育复杂和价格高昂的局限。相关研究显示这些动物模型普遍存在维生素D通路激活的特点,并且我们先前的研究也证实结石病人存在血活性维生素D水平增高。因而我们拟通过单纯给予Sprague-Dawley大鼠活性维生素D,尝试建立一种相对简便、经济、可重复的高钙尿结石动物模型。方法:取6周龄雄性Sprague-Dawley大鼠,随机分为维生素D造模组(24只)、对照组(18只)和乙醛酸造模组(6只),正常饮食和饮水。维生素D造模组按100ng/100g体重隔日腹腔注射2ng/ul的1,25(OH)2D3溶液。在第2、4、8和12周时测量体重并测定24小时尿钙。在第4周、8周和12周随机处死8只大鼠,取血测定血钙、血磷和肝肾功能等指标。留取肾脏,行HE和Von Kossa染色观察显微结构以及钙盐沉积和结石形成情况,行扫描电镜观察超微结构,行microCT平扫和三维重建整体观察肾脏钙盐沉积和结石形成情况。对照组大鼠除隔日腹腔注射对应剂量溶剂和定期处死6只大鼠外,其余处理和检测指标与维生素D造模组相同。乙醛酸造模组大鼠按照10mg/100g体重每日腹腔注射乙醛酸溶液,连续注射10天。10天后处死取肾脏行HE和Von Kossa染色观察其显微结构以及及钙盐沉积和结石形成情况,并与维生素D造模组比较钙盐沉积的分布。结果:维生素D造模组大鼠体重在第4至12周时显著低于对照组大鼠,肝功能和肾功能指标在各周与对照组无明显差异。维生素D组大鼠血钙在各个时间点均显著高于对照组,而血磷仅在第4周低于对照组。维生素D组尿钙浓度以及24小时尿钙均显著高于对照组。维生素D造模组大鼠在第4周时,在micro CT上偶见肾实质钙盐沉积;在第8周时,石蜡切片VonKossa染色在肾内层髓质肾乳头部位可见明显钙盐沉积,肾盂可见结石形成,microCT可见明显肾实质钙化和结石形成;在第12周时,钙化程度进一步加重。行扫描电镜观察见肾间质钙化由小的板片状或同心圆样矿质沉积聚集而成,能谱分析显示其成分主要包含钙和磷元素;肾盂结石则中心结构较为疏松,外层包绕板层状致密矿质结构,其成分亦包含钙和磷元素。与维生素D造模组大鼠不同,乙醛酸造模组大鼠肾脏钙盐沉积主要位于皮质和髓质交界处,且钙盐沉积主要位于管腔内。结论:按100ng/100g体重隔日腹腔注射1,25(OH)2D3可以诱导大鼠出现高钙尿、肾间质磷酸盐钙化和肾盂结石。本模型可应用于肾间质钙化和高钙尿结石的研究,且优化造模方法可进一步优化。第三部分高浓度1,25(OH)2D3和Ca2+诱导肾间质钙化和结石形成的生物学机制研究背景和目的:Randall钙斑是位于肾间质的钙化,可能是肾结石形成的起始病变,而1,25(OH)2D3及其诱导的高钙尿可以促进肾间质钙化和肾结石形成。本研究拟进一步证实Randall钙斑与结石的相关性,并探究高浓度1,25(OH)2D3和Ca2+促进肾间质钙化和肾结石形成的生物学机制。方法:基于腹部CT平扫影像学图片,比较性别和年龄相匹配的结石患者和非结石患者肾乳头密度(HU值),以进一步验证Randall钙斑理论。基于结石患者和非结石患者肾乳头组织芯片数据,靶向分析与抑制异位钙化相关基因包括基质Gla蛋白(MGP)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)、骨保护素(OPG)和富Gla蛋白(GRP)在结石患者和非结石患者肾乳头的表达情况,进而确定本研究的核心分子。在动物和/或细胞水平对上述核心分子基因表达情况及其功能进行验证,并分析高钙和高维生素D对细胞增殖、凋亡、氧化应激、细胞损伤修复以及细胞与晶体的相互作用等生物学功能的影响。结果:最终纳入性别和年龄相匹配的结石和非结石患者各50例,结石组患者肾乳头密度均值显著高于非结石患者(49.81±7.12vs 40.98±5.68)。对26例草酸钙结石患者和6例非肾结石对照者的肾乳头组织基因芯片数据进行分析显示,结石患者肾乳头MGP表达下调3.15倍(p=0.05),OPN、OPG、OCN和GRP表达分别上调 1.93(p=0.52)、1.16(p=0.58)、1.57(p=0.06)和 2.04(p=0.08)倍。免疫组织化学染色显示造模组大鼠间质钙化区域MGP染色强阳性,且钙化周围包绕着成纤维细胞特异蛋白1阳性细胞。进一步免疫组织化学染色和免疫印迹结果显示造模组大鼠肾髓质MGP表达较对照组降低,细胞免疫荧光和免疫印迹研究发现高钙和高维生素D抑制了肾小管上皮细胞MGP表达。茜素红染色实验发现高钙和高维生素D可诱导大鼠肾成纤维细胞周围出现钙盐沉积,而外源性补充浓度为0.1ug/ml或0.5ug/ml的MGP后,钙化则明显减少甚至消失。造模组大鼠肾组织脂质过氧化产物丙二醛显著增高,TUNEL染色显示肾小管细胞凋亡增多。CCK8细胞增殖实验、流式细胞术、划痕实验以及晶体粘附实验证实,高钙高维生素D培养基可显著抑制肾小管上皮细胞增殖、诱导肾小管上皮细胞凋亡,并抑制肾小管上皮细胞损伤修复能力,促进肾小管上皮细胞对一水草酸钙晶体的粘附,但未促进其对磷酸钙晶体的粘附。结论:肾乳头钙化与结石密切相关,活性维生素D联合其诱导的高钙微环境可能通过下调MGP的表达,同时提高肾脏的氧化应激水平、促进肾小管上皮细胞凋亡、抑制肾小管上皮细胞增殖和损伤修复来促进间质钙化产生和后续结石形成。