近红外荧光蛋白的最大激发和发射波长都处于组织成像"光学窗口"的范围内,使其在活体深层组织成像中得到广泛的应用。研究人员可以将该类蛋白标记上自己感兴趣的分子,从而可以直观、动态的监测该分子在活体中的所可能发挥的作用。这种利用荧光成像的方式进行研究的手段,为生物领域的快速发展提供了又一个强有力的技术支持。尽管,目前已经少数近红外荧光蛋白产生,但是这些荧光蛋白仍有进化的空间,部分光学性质仍需要改善,如,激发和发射波长的红移,pH稳定性,单体性质,量子产率增加,成熟速率加快等。这些性质对荧光蛋白运用于体内成像具有重要意义。关键性质,一直是研究者们对荧光蛋白进化时的主要指标。近年来我们实验室通过体外进化,获得了系列近红外荧光蛋白。其中,mNeptune684拥有目前最长的发射波长,其最大激发/发射为604/684 nm。然而,稍微遗憾的是,其量子产率仅为0.03,由于结构的原因,当发色团处于的平面性得到确保并且其旋转的自由度也同样受限的环境中时,才会产生较高的量子产率,而随着荧光蛋白波长的红移会逐渐增加维持上述环境的难度,最终导致波长越红移,其量子产率越低的现象,因此限制了该蛋白在体内成像中的运用。本研究将从提高量子产率方面来对该荧光蛋白进行改造。研究思路是通过对蛋白晶体结构分析理性设计以及随机突变的方式来共对mNeptune684进行体外进化,其关键在于保证mNeptune684荧光蛋白的发射波长不会发生蓝移的前提下,尽可能的提高其量子产率。具体实验主要分为以下两个方面:其一,参考其他研究者们对ECFP的β折叠片的改造,来稳定发色团结构,从而提升量子产率的方法,对mNeptune684的β折叠也引入类似的理念。文章中提到将ECFP第七折叠片中148位的His突变成Asp后,第七β-折叠片与第十β-折叠片形成更为稳定的氢键相互作用,从而稳固的发色团的外部结构,最终达到稳定发色团的效果。而对于mNeptune684这个蛋白,通过晶体结构的分析,我们发现该蛋白桶状结构中第七个β-折叠片上有一段无规卷曲,从而使结构较为松散,而该螺旋涉及141/142两个位点的氨基酸,并着手对其进行突变。在此期间我们通过二级结构预测软件来缩小突变氨基酸的范围,但是所得突变体不是丢失了荧光就是发射波长蓝移,因此没有得到满意的结果;其二,回归到对发色团周围氨基酸的分析,从氨基酸侧链与发色团之间氢键相互作用入手,来发现能稳定发色团的突变。同样通过晶体结构分析,在mNeptune684中Asn143和Asn158扩展了发色团周围的氢键网络,对其光谱红移起到了很大的作用,同时还有Arg155、His157和Pro159之间的氢键作用,使得发色团的空间构象得到稳定。由于上述氨基酸突变都集中在发色团对羟基苯亚甲基(p-hydrroxybenzylidene)基团周围,所以本研究选取的突变位点都集中在发色团的另一头,酰基亚胺(acylimine)基团的周围。经筛选,最终得到将Metll突变成Val的突变体mNeptune684_M11V,其量子产率为0.07,与亲代的mNeptune684相比有近2.5倍的提高,并能运用到细胞进行成像,未来,我们将尝试将该蛋白应用于动物活体成像。