背景资料 急性胰腺炎是一种能够引起复杂的全身反应的一种急性炎症，其临床上总死亡率约10％左右，但重症病例的死亡率可达20-30％。大多数重症患者死亡原因多为多脏器功能衰竭(MOF)，其中包括急性呼吸功能、肝功能和肾功能的衰竭。目前急性胰腺炎的病理机制尚未完全明了，但许多研究已证实中性粒细胞的过度活化在急性胰腺炎病理损害加重及并发多脏器功能衰竭乃至死亡中起了一个中心枢纽作用，在各种炎性介质、细胞因子的作用下中性粒细胞通过脱颗粒释放的氧自由基、弹力酶等毒性物质是胰腺局部及全身脏器损害的主要介质。 目前已知，促炎性细胞因子如TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8、PAF，一些黏附分子如ICAM-1、β整合素和自由基等均参与了胰腺炎局部损害加重及伴发远隔脏器功能衰竭的病理过程；一些研究试图通过应用这些细胞因子的拮抗剂来治疗胰腺炎，但由于参与的细胞因子种类繁多，但用一种细胞因子拮抗剂很难取得良好效果。近年来这些因子被认为通过增加毛细血管通透性，促使中性粒细胞向炎症部位黏附、浸润并最终通过激活中性粒细胞来达到局部和全身病理损害的；因此，及时清除掉已激活的中性粒细胞在很大程度上能够改善重症胰腺炎的预后。在重症胰腺炎时，活化的中性粒细胞自发凋亡延迟，这就意味着更多的粒细胞毒性物质被释放，从而导致炎症反应持续不断扩大。 中性粒细胞是寿命最短的、已分化的终末细胞，正常情况下自发走向凋亡。中性粒细胞的自发凋亡在急性炎症消退、防止出现继发组织损伤中起重要作用。许多证据显示，凋亡是使中性粒细胞失活的重要途径；在凋亡过程中，中性粒细胞丧失了黏附、吞噬、脱颗粒和释放炎性介质的能力，并很快被巨噬细胞所吞噬掉；这种胞膜完整状态下的粒细胞清除可避免像粒细胞坏死时大量细胞内毒性物质的释放。中性粒细胞凋亡后被巨噬细胞吞噬，吞噬细胞不但不释放促炎介质，反而释放抑制炎症反应的因子，如TGF-β，PGE2等。许多报道证实烧伤、重症感染、全身炎症反应综合征和再灌注损伤的病人均伴有外周血中性粒细胞凋亡延迟。由于中性粒细胞可通过多种途径损伤机体，粒细胞的凋亡延迟就意味着持续的炎症反应，并进一步可导致多脏器功能衰竭。 中性粒细胞可表达一系列Bcl-2家族蛋白，但由于人们应用不同的检测手段，这方面还有很多争议。目前已公认的是中性粒细胞不表达Bcl-2蛋白，但常规表达促凋亡蛋白Bax、Bak、Bid和Bad，这些促凋亡蛋白的半衰期相对较长，因此它们的持续表达可以解释为什么外周血中PMN生存期如此之短(6-10小时);同时中性粒细胞也表达抗凋亡蛋白A1、Bcl-xl、Mcl-1，但抗凋亡蛋白表达时间很短暂(半衰期仅2-3小时)离体培养很快消失，因此，中性粒细胞凋亡是受半衰期短暂的抗凋亡蛋白A1、Bcl-xl、Mcl-1的调控。在没有新合成抗凋亡白A1、Bcl-xl、Mcl-1的情况下，半衰期长的促凋亡基因(主要是Bax)的活性占优势，导致粒细胞凋亡。然而，当生存信号存在时(如细胞因子)，抗凋亡蛋白合成增加，粒细胞出现凋亡延迟。 目前关于急性胰腺炎时PMN凋亡方面的研究极少，胰腺炎时外周血中性粒细胞凋亡延迟的具体信号传导方面更不清楚。尽管有报道发现了粒细胞在细胞因子如TNF-a、内毒素等单因素刺激下凋亡延迟的一些信号通路，但总的来说粒细胞凋亡延迟的具体通路还远未揭示。不同的细胞因子或刺激因素可通过不同激活不同的蛋白激酶、转录因子来发挥其促凋亡或抗凋亡的效应。由于重症胰腺炎时外周血中大量的细胞因子、活性氧、一氧化氮、炎性介质、各种蛋白酶等均被激活，单因素刺激下粒细胞凋亡延迟的信号途径并不能解释胰腺炎时粒细胞凋亡延迟的具体通路。近年来，细胞外信号调控的蛋白激酶(ERK)和细胞核转录因子NF-kB被认为是细胞生存的两大重要传导通路，而它们在胰腺炎粒细胞凋亡中的作用还未见报道，本实验建立重症胰腺炎动物模型，在体外培养的中性粒细胞中用ERK、NF-kB特异性阻滞剂来探讨ERK、NF-kB的激活在SAP时外周血中性粒细胞凋亡延迟中的作用。 实验方法 1.动物模型的建立：重症胰腺炎模型采用用微量泵向大鼠胆胰管内逆行注射3％的牛黄胆酸钠0.3ml来建立，假手术组仅作小切口开腹再缝合，PDTC组在建立胰腺炎模型前30分钟大鼠皮下注射PDTC(50mg/kg体重)的生理盐水8ml，重症胰腺炎组、假手术组仅注射等量生理盐水，6小时后重复注射盐水或PDTC。 2.大鼠外周血中性粒细胞的分离 Wister大鼠乙醚麻醉后经下腔静脉取抗凝血8-10ml，加入20ml无菌试管中，加入葡聚糖T-500，室温下沉淀红细胞45分钟，取上层富含粒细胞的血浆，小心叠加于离心管中不连续密度梯度的percoll上面(含2ml65％的percoll叠加在2ml76％的percoll上)，保持各界面清晰，1500转20分钟，取中性粒细胞层，残余红细胞裂解后可得到纯度和活性大于95％的中性粒细胞。 3.血浆的制备SAP大鼠、假手术大鼠、PDTC治疗组的大鼠取抗凝血，1000转离心15分钟，可得到各组血浆，血浆直接加入培养液中，体积比是1∶4。 4.大鼠中性粒细胞体外培养无菌的外周血中性粒细胞悬浮于RPMIl640培养液中(10％的胎牛血清，青、链霉素)1ml/孔加入24孔板中浓度为2×106/ml，CO2培养箱中培养0.5-16小时。 ①SAP组，PDTC组，假手术组PMN体外培养16小时，细胞涂片，TUNEL法测定凋亡率。 ②正常PMN在预先分别加入或不加PDTC(1uM/ml)、PD98059(0.3uM/ml)的培养液中孵育30分钟后，培养液中分别加入SAP大鼠、假手术大鼠血浆，30分后各取6个孔的细胞，涂片固定检测NF-kB、pERK2的表达，6小时时再分别取6个孔细胞，检测Bcl-xl、Bax的表达，16小时取细胞检测凋亡率，用TUNEL和流式细胞仪检测两种途径。 ③SAP大鼠PMN在预先分别加入或不加入PDTC(1uM/ml)、PD98059(0.3uM/ml)的培养液中孵育30分钟后，培养液中分别加入SAP大鼠、正常大鼠血浆，16小时后细胞冲洗两次、冷乙醇固定过夜，PI染色流式细胞仪检测凋亡率。 5.凋亡的检测 流式细胞仪检测细胞用70％冷乙醇固定12小时后，1mlPI染色，流式细胞仪通过检测DNA断片所占比例来得出凋亡率。 TUNEL法检测凋亡形态学改变4％多聚甲醛固定后的细胞涂片，用TUNEL检测试剂盒(宝灵曼公司，FITC直接标记dUTP)检测，标记后的细胞图片用荧光显微镜观测，以强黄绿色荧光为阳性，查100个细胞，计算阳性百分率。 6.NF-kB、ERK活化的检测 7.Bax、Bcl-xl的表达一抗为博士德公司生产的兔抗Bax、兔抗Bcl-xl，DAB发色，光学显微镜下观察。 结果 SAP大鼠建模24小时后，可见腹腔内大量血性腹水、皂化斑、胰腺高度肿胀，后腹膜水肿明显；光镜下胰腺可见明显充血水肿，胰腺大片腺泡结构坏死消失，炎性细胞浸润。PDTC组也有大量血性腹水、皂化斑、胰腺肿胀，较SAP组光镜下胰腺病理改变未见明显减轻。但PDTC组肺脏充血水肿较SAP组轻，光镜下见肺泡内粒细胞浸润、肺泡隔增宽明显减轻 1.胰腺炎血浆对正常鼠中性粒细胞NF-kB的激活 2.胰腺炎血浆对正常鼠中性粒细胞Bcl-2家族蛋白的表达的影响 3.NF-kB、ERK的活化与SAP血浆孵育的正常PMN凋亡延迟的关系 4.SAP大鼠血浆对SAP大鼠PMN凋亡率的影响 结论 1.通过比较重症胰腺炎大鼠、假手术大鼠、PDTC治疗组大鼠PMN体外培养16小时的自发凋亡率，证实重症胰腺炎大鼠PMN自发凋亡明显延迟，皮下注射NF-kB抑制剂PDTC可明显恢复其自发凋亡率。 2.通过应用SAP血浆体外刺激正常PMN，证实SAP血浆可引起PMN中ERK、NF-kB的活化，和抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达增加，同时可使正常PMN的自发凋亡率明显延迟。 3.通过预先应用ERK特异性抑制剂PD98059来抑制其活化，再用SAP血浆刺激正常PMN，可见抑制ERK的活化可完全逆转SAP血浆引起的正常PMN凋亡延迟，在一定程度上抑制NF-kB的活化及抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达；证实SAP血浆通过激活ERK来引起正常PMN凋亡延迟，ERK的激活可在一定程度上参与NF-kB的激活和Bcl-xl蛋白表达增加 4通过预先应用NF-kB抑制剂PDTC来抑制其活化，再应用SAP血浆刺激正常PMN，可见抑制NF-kB的活化可完全逆转SAP血浆引起的PMN凋亡延迟和Bcl-xl表达的增加，证实SAP血浆可通过活化NF-kB来介导正常PMN凋亡延迟，NF-kB的激活可调控Bcl-xl的表达增加 5.通过应用SAP血浆体外刺激SAP大鼠的PMN，可见SAP血浆可使SAP大鼠PMN的凋亡率进一步明显减少，预先应用NF-kB、ERK抑制剂可恢复其凋亡率到SAP大鼠PMN自发凋亡率，说明SAP血浆可进一步激活抗凋亡信号，使己出现凋亡延迟的PMN凋亡率进一步减少。