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目的 人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)是引起宫内感染进而导致婴儿先天性发育畸形的常见病原。HCMV感染可引起不同的临床表现，其发病机制不清，可能与宿主的体液和细胞免疫状态有关，亦可能与不同临床分离株基因及其编码产物的多态性有关。资料表明，HCMV UL／b’区在临床低传代分离株和实验室株中表现出极大的遗传多态性。本文主要研究该区基因之一UL136在临床低传代分离株中的多态性，探讨其多态性与HCMV先天性感染不同致病性之间的关系，力图为揭示该基因编码产物的功能及先天性HCMV感染的致病机理奠定分子基础。 材料与方法 一、标本来源 48株低传代临床分离株均来自1988-1993年我院住院患儿，年龄(14个月，其中黄疸28株，小头畸形11株，先天性巨结肠9株。标本取自病毒分离实验，-70℃保存。低传代分离株传代少于10次。2000年应用荧光定量PCR方法检测HCMV-DNA，结果均为阳性。 二、实验方法 1、标本处理 取HCMV低传代分离株细胞培养上清液与等量裂解液混匀后，煮沸15分钟，提取DNA，作为扩增模板。 2、引物设计 按照Toledo株序列，应用引物设计软件primer premier5．0设计用于扩增HCMV UL136基因的全序列引物和鉴定引物。 全序列引物 上游引物 UL136ca：5’TCGGACATCGAGGAACTCI’tvi 3’ 下游引物UL136Cb：5’GTGCCAGTGGTAAGCCAGATA3’ 鉴定引物 上游引物 UL136UI：5’GAATGTCGGCTACGGGTG 3’ 下游引物 UL136DI：5’TGTCTCGCCAAC’I’GTCTG 3’ 下游引物 UL137DI：5’TCACGCCGATGAGGGTA 3’ 3、UL136基因PCR扩增 PCR循环条件如下：预变性95℃，4分钟；96℃变性45秒，55℃退火1分钟，72℃延伸至分钟30秒书个循环；72℃终延伸，10分钟。＊5％经漠化已锭染色的琼脂糖凝胶电泳后，紫外检测仪下观察扩增结果。 4、凝胶回收 应用PCR目的基因片段回收试剂盒对扩增阳性PCR产物进行凝胶回收，纯化目的DNA片段。 5＊CR阳性扩增产物测序 6、序列分析 应用软件 DNAClub，BioEdit，Genedoc，DNASis，DNAStar完成序列分析。 7、序列提交 用Setwn软件向 GenBank提交整理后的HCMV UL136 ORF序歹。 实验结果 一JCR扩增结果 对 48株低传代临床分离株进行 HCMV UL136全序列 PCR扩增，结果18株阳性，阳性率37．5％，其中黄疽12株，小头畸形4株，先天性巨结肠2株。 ·2· 二月136基因编码区及编码产物氨基酸序列的多态性 ＼＊ 株临床低传代分离株UL136 ORF长度均与TOedo株相同，为 723hp，预测编码 241个氨基酸的蛋白。 2山NA序列变异均为核耷酸替换，无插人和缺失突变。 3、不同临床分离株UL13。5基因与ToedO株进行同源性比较，结果在核着酸水平为97．7％－99．3％，氨基酸水平为96．6％－99．二％。UL136编码蛋白的氨基酸变异率为0．83％－3．3％。 4、氨基酸变异位点多集中于序列中部，两端变异较少。 5、绝大多数氨基酸变异为非保守替代，改变了氨基酸的极性和电荷。 6、半既氨酸在三个位点存在变异。 三JL136编码蛋白翻译后修饰位点分析结果 翻译后修饰位点散在分布于整个氨基酸序列。大多数HCMVUL136蛋白翻译后修饰位点在所有分离株中均高度保守，仅三个位点在一些分离株中存在缺失或新增。 四刀L136编码蛋白性质预测结果 预测UL136编码蛋白分子量约为27．3kD，等电点为7．54－8．sl，为弱碱性蛋白。7株临床分离株在175－185位之间氨基酸序列形成一个新的转角，导致 UL136蛋白H级结构预测分为两种构象。 五、ToledO株及18株临床分离株核着酸及氨基酸序列系统进化树分析结果 未发现不同临床分离株UL136基因多态性与HCMV先天性感染不同疾病表现的关系。 本 论 人巨细胞病毒基因组表现极大的遗传多态性，这种株依赖的多态性可能与HCMV感染的组织细胞嗜性、毒力及免疫逃避机制 ·3·有关。人们曾推测，HCMV在体内广泛的组织分布可能与主要包膜糖蛋白gB基因的多态性有关。根据gB蛋白基因断裂区PCR产物的限制性片段长度多态将其分为4个基因型。但目前尚未证实HCMV感染疾病表现与gB基因型有本质联系。 1999年，MacCormac等的实验结果表明：TOledo株及两株临床分离株存在与实验室株不同的细胞嗜性，说明决定HCMV感染受累细胞或器官不同的基因有可能定位于AD169等实验室株缺失的19个ORF’中。正是这些新基因编码产物在HCMV感染中可能存在的重要作用，促使我们去研究它们在不同分离株中多态性及其与致病性的关系。 对48株临床分离株进行了UL136全序列PCR扩增，阳性18株，阳性率 37．5％。阴性结果如果排除扩增条件的影响，可能为模板与引物结合区DNA序列不完全互补，亦不能完全排除UL