【摘 要】
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柠檬烯及其衍生物紫苏酸是一类具有多种药理和生理活性的单环单萜化合物,应用潜力巨大,市场前景广阔。这些单萜类化合物广泛存在于天然植物精油中,工业生产中采用天然材料提取法和化学合成法,而高底物成本和低转化率是生产的限制因素。热带假丝酵母具有强的ω-氧化途径和β-氧化途径,细胞内的乙酰辅酶A水平相对较高,可在胞内积累较高含量的脂质,是萜类化合物高效生产的优良底盘细胞。通过系统代谢工程和合成生物学技术改造
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柠檬烯及其衍生物紫苏酸是一类具有多种药理和生理活性的单环单萜化合物,应用潜力巨大,市场前景广阔。这些单萜类化合物广泛存在于天然植物精油中,工业生产中采用天然材料提取法和化学合成法,而高底物成本和低转化率是生产的限制因素。热带假丝酵母具有强的ω-氧化途径和β-氧化途径,细胞内的乙酰辅酶A水平相对较高,可在胞内积累较高含量的脂质,是萜类化合物高效生产的优良底盘细胞。通过系统代谢工程和合成生物学技术改造热带假丝酵母,发酵廉价底物生产高附加值萜类化合物有实际意义。本研究主要构建了热带假丝酵母生产柠檬烯及其衍生物紫苏酸的工程菌株并且对其进行了发酵优化。论文主要结果如下:（1）构建了可生产柠檬烯的热带假丝酵母工程菌株并研究了截短柠檬烯合成酶对其产量的影响。构建柠檬烯合酶LS基因表达盒并将其转化整合到酵母基因组实现异源表达,实现了柠檬烯在热带假丝酵母中的合成,产量可达到0.092 mg?L-1。进一步通过表达截短柠檬烯合酶的N端序列的t LS基因,产柠檬烯浓度较初始浓度提高了2.78倍。（2）探究了热带假丝酵母亚细胞区室化合成柠檬烯的能力。构建t LS基因在热带假丝酵母线粒体和过氧化物酶体中的表达盒并分别转化进入酵母基因组实现表达,两者均有柠檬烯产生,产量分别为0.236 mg?L-1和0.105 mg?L-1。这表明t LS在线粒体和过氧化物酶体中是有活性的,柠檬烯的前体物质GPP能够穿越细胞质进入线粒体和过氧化物酶体中并进行柠檬烯的合成。通过进一步优化,在各甲羟戊酸MVA途径中关键酶过表达的工程热带假丝酵母菌株的基础上,整合表达t LS基因,柠檬烯产量在细胞质中进一步提高了31.68倍,较过氧化物酶体和线粒体中分别提高了12.1倍和8.91倍。（3）探究关键酶法尼基焦磷酸合成酶ERG20及其突变体ERG20WW区室化表达对柠檬烯产量的影响。ERG20基因的过表达使柠檬烯产量较对照菌株有了明显的降低,分别在细胞质、过氧化物酶体和线粒体中降低了90.51%、23.52%和2.76%;ERG20WW酶的过表达使柠檬烯产量较对照菌株有了显著的提高,分别在细胞质、过氧化物酶体和线粒体提高了11.33倍、5.85倍和0.3倍。通过优化发酵时间和发酵培养基中起始糖浓度,在发酵时间为5 d,培养基糖浓度为60 g?L-1的条件下,柠檬烯产量达到141.48 mg?L-1,较初始产量提高了1536.8倍。（4）将来源于植物的细胞色素P450基因CYP71A76在热带假丝酵母中的异源表达实现了紫苏酸的产生,工程菌株的摇瓶紫苏酸产量达到7.19 mg?L-1。在5 L发酵罐水平,紫苏酸产量达到了106.69 mg?L-1,与摇瓶发酵水平相比较提高了13.8倍。
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