绒山羊毛囊是羊毛、羊绒的发生器官,羊绒品质主要由其控制,因此研究影响毛囊生长的因素及调控其生长衰退的机理对于研究毛囊的发育和毛发的生长有着巨大的意义。由于体内影响毛囊生长的因素众多,不利于单一因素对毛囊生长的研究,因此建立体外游离毛囊培养模型,以尽量避免体内复杂因素的影响。寻找游离绒山羊毛囊培养的最佳条件,通过对毛囊细胞生物学的研究,探讨毛囊生长发育的调控机制和影响毛囊生长的因素。针对以上相关问题,本论文以绒山羊毛囊体外培养为基础,并比较了不同培养基对毛囊培养的影响;利用组织法和消化法进行了毛乳头细胞的分离、培养、传代和冻存;通过对游离绒山羊初级毛囊和绵羊毛囊的培养,观察不同毛囊各生长阶段的组织结构特征;应用绒山羊毛囊体外培养模型研究雌激素对体外绒山羊初级毛囊生物学特性的影响;又进一步从分子生物学水平,利用体外培养的绒山羊皮片研究雌激素对Bcl-2、Bax基因表达量的调节作用。试验结果如下:1.对传统分离方法进行改进,参照Philpott[55]的方法,通过显微解剖法和切割法的结合,将绒山羊皮肤剪成大约(3～5)mm×10mm大小的皮片(只含单层毛囊),当毛囊宽度适宜时可以获得更多的游离毛囊,应选用外毛根鞘完整、毛乳头形态圆润光滑的生长期毛囊进行培养。同时为了便于观察和测量以及毛囊的生长,我们认为分离后的毛囊长度约为2～3mm时最适合毛囊的生长和观察。2.成功进行了游离毛囊的体外培养,并发现初级毛囊在含血清DMEM培养基中生长速度缓慢,扭曲变形早,平均在4天左右开始贴壁;而使用无血清DMEM培养基初级毛囊生长天数明显延长,毛囊的层次结构及形态可长时间保持不变,但从第2天开始生长速度与含血清培养时无明显差异(P>0.05);使用Williams E无血清培养基初级毛囊在前5天生长速度明显加快,而初级毛囊在Williams E无血清无转铁蛋白培养基中生长速度较Williams E无血清培养的慢,但毛囊存活时间与在Williams E无血清培养基中的无明显差别(P>0.05),说明转铁蛋白有助于毛囊的生长和形态的维持。实验证明Williams E无血清培养更适合于绒山羊毛囊的体外培养。3.利用Williams E无血清培养基对绒山羊次级毛囊进行培养,前3天的平均生长速度为0.031mm/d,接近于绒山羊体内绒毛同期生长的平均情况(0.056mm/d),但次级毛囊的生长时间有限,维持时间短。4.对不同时期初级毛囊进行体外培养,结果发现11月份的初级毛囊前3天的平均生长速度为0.08mm/d,与体内初级毛囊同期的平均生长情况相同(0.08mm/d),且体外培养单天生长速度最大值(0.09mm/d)大于体内单天生长速度的最大值(0.087mm/d)。生长情况好于体外9月份的生长情况,与初级毛囊在体内的活性在9月份达到最高峰相反,由此可以推断毛囊的活性与温度密切相关。5.利用胶原酶消化和机械分离相结合的方法分离处于生长期的内蒙古绒山羊初级毛囊毛乳头细胞,并成功培养。在倒置显微镜下毛乳头细胞呈成纤维细胞形态,具有多层凝集特性。6.对体外游离山羊初级毛囊与绵羊毛囊的生长进行比较。在培养过程中,绵羊毛囊的日平均生长速度明显高于绒山羊毛囊的生长速度,但各自在前3天的生长均能保持相对稳定的水平,并与体内毛囊的生长速度接近。随着培养时间的延长,绵羊毛囊的生长速度急剧下降,而绒山羊初级毛囊在前9天的生长情况始终较为稳定,毛囊形态变化较规律。表明:选择31℃、Williams E无血清培养基进行绒山羊初级毛囊和绵羊毛囊培养有利于毛囊的生长。7. 17-β-雌二醇对绒山羊初级毛囊的生长没有促进作用。0.1nmol/L组与对照组生长速度无明显差异(P>0.05),这可能与此浓度与体内雌二醇生理浓度(0.05～0.19nmol/L[244])基本相同,且毛囊生长速度略好与对照组,在前10d基本保持在一个相对较快的水平上,在培养后期部分毛囊会出现下段弯曲。随着17-β-雌二醇浓度的增加毛囊的生长受到抑制,100nmol/L组对毛囊的生长明显抑制(P<0.01),大部分毛囊在培养第9d左右停止生长进入退行期。8.体外培养24h的山羊皮片,分别添加不同浓度的17-β-雌二醇,分别培养24h、48h、72h、96h、120h后运用实时定量PCR方法检测凋亡调控基因Bcl-2、Bax表达情况。结果显示:添加了雌二醇的各组毛囊Bcl-2mRNA表达量随浓度的增加而逐渐减少,说明在雌二醇的作用下,体外培养毛囊的Bcl-2mRNA表达显著下降。而Bax mRNA表达量各组均表现出先增加后逐渐下降的趋势。雌二醇能够降低Bcl-2/Bax mRNA比率,但各组二者比值(Bcl-2/Bax)之间均无显著差异,由此可以推断雌二醇具有促进毛囊细胞凋亡的作用。