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目的:本文旨在研究还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(Nicotinamide adeninedinucleotide phosphate,NADPH)在心肌缺血再灌注损伤后的保护作用,并探讨其心肌保护作用的潜在分子机制。
方法:在体实验中采用心脏左前降支结扎术构建大鼠心肌缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤模型。SD大鼠随机分为6组(n=6):假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、NADPH4mg/kg处理组(N4组)、NADPH8mg/k处理组(N8组)、NADPHl6mg/kg处理组(N16组)和地尔硫卓处理组(Diltiazem组)。假手术组除了没有结扎左前降支血管外,其余手术操作均与I/R组相同,给药组在复灌开始即刻静脉给予16m∥kg的NADPH,并在5min内注射完毕。复灌2h后取大鼠心脏,心肌梗死面积利用Evans B1ue和TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)双重染色法计算。假手术组从假定缺血区域摘除心脏组织。使用NADP+小ADPH,NAD+/NADH试剂盒检测心肌组织和血浆中的NADH和NADPH含量。乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒和肌钙蛋白I(cTnI)检测试剂盒测定心肌组织损伤水平。运用DHE探针标记检测大鼠心肌造模组及给药组的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平的变化。
细胞实验通过培养新生大鼠心肌细胞(NRCM),利用HBSS孵育NRCM并用95%N2和5%O!建立氧糖剥夺复灌(Oxygen-glucose-deprivation/Restoration,OGD/R)模型。利用细胞计数试剂盒(Cell Counting Lit-8,CCK-8)检测指标选择适宜的NADPH浓度。实验随机分为4组:对照组(CON组)、氧糖剥夺复灌组(0GD/R组)、OGD/R+小剂量给药组(N(L)组)和OGD/R+大剂量给药组(N(H)组)。利用流式细胞仪、Hoechst染色检测NADPH在损伤的心肌细胞中的保护作用。
动物和细胞模型运用Western blot法检测心肌损伤凋亡相关蛋白,并进一步检测AMPK-mTOR信号通路蛋白的表达情况。
结果:在体实验中,证明NADPH可以通过细胞膜进入心肌细胞发挥其保护作用。给予外源性NADPH可以降低心肌梗死面积,并且可以降低大鼠血清LDH和cTnI的水平,在16mg/kg浓度时心肌保护作用最明显。缺血缺氧诱导线粒体生成ROS,线粒体膜蛋白COXIV和TOM20表达降低,给予NADPH(16mg/kg)后减少了ROS的生成,COXIV和TOM20含量表达增加。
NRCM经OGD/R24h后,NADPH60nM(N(L)组)预处理显著提高细胞存活率。在缺糖缺氧诱发的NRCM损伤中,小剂量NADPH显著降低cleaved PARP和cleaved-caspase3蛋白表达水平,能够显著降低心肌细胞凋亡率,同时在体内实验中也可以看到相同的结果。NADPH可以促进AMPK的磷酸化,下调mTOR的表达。在体外给予AMPK抑制剂Compound C,可以抑制AMPK的磷酸化,减弱NADPH的心肌保护作用。
结论:外源性NADPH通过激活AMPK/mTOR通路和抑制心肌细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤中发挥保护作用。NADPH可能成为预防和治疗心肌缺血性疾病的潜在靶点。
方法:在体实验中采用心脏左前降支结扎术构建大鼠心肌缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤模型。SD大鼠随机分为6组(n=6):假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、NADPH4mg/kg处理组(N4组)、NADPH8mg/k处理组(N8组)、NADPHl6mg/kg处理组(N16组)和地尔硫卓处理组(Diltiazem组)。假手术组除了没有结扎左前降支血管外,其余手术操作均与I/R组相同,给药组在复灌开始即刻静脉给予16m∥kg的NADPH,并在5min内注射完毕。复灌2h后取大鼠心脏,心肌梗死面积利用Evans B1ue和TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)双重染色法计算。假手术组从假定缺血区域摘除心脏组织。使用NADP+小ADPH,NAD+/NADH试剂盒检测心肌组织和血浆中的NADH和NADPH含量。乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒和肌钙蛋白I(cTnI)检测试剂盒测定心肌组织损伤水平。运用DHE探针标记检测大鼠心肌造模组及给药组的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平的变化。
细胞实验通过培养新生大鼠心肌细胞(NRCM),利用HBSS孵育NRCM并用95%N2和5%O!建立氧糖剥夺复灌(Oxygen-glucose-deprivation/Restoration,OGD/R)模型。利用细胞计数试剂盒(Cell Counting Lit-8,CCK-8)检测指标选择适宜的NADPH浓度。实验随机分为4组:对照组(CON组)、氧糖剥夺复灌组(0GD/R组)、OGD/R+小剂量给药组(N(L)组)和OGD/R+大剂量给药组(N(H)组)。利用流式细胞仪、Hoechst染色检测NADPH在损伤的心肌细胞中的保护作用。
动物和细胞模型运用Western blot法检测心肌损伤凋亡相关蛋白,并进一步检测AMPK-mTOR信号通路蛋白的表达情况。
结果:在体实验中,证明NADPH可以通过细胞膜进入心肌细胞发挥其保护作用。给予外源性NADPH可以降低心肌梗死面积,并且可以降低大鼠血清LDH和cTnI的水平,在16mg/kg浓度时心肌保护作用最明显。缺血缺氧诱导线粒体生成ROS,线粒体膜蛋白COXIV和TOM20表达降低,给予NADPH(16mg/kg)后减少了ROS的生成,COXIV和TOM20含量表达增加。
NRCM经OGD/R24h后,NADPH60nM(N(L)组)预处理显著提高细胞存活率。在缺糖缺氧诱发的NRCM损伤中,小剂量NADPH显著降低cleaved PARP和cleaved-caspase3蛋白表达水平,能够显著降低心肌细胞凋亡率,同时在体内实验中也可以看到相同的结果。NADPH可以促进AMPK的磷酸化,下调mTOR的表达。在体外给予AMPK抑制剂Compound C,可以抑制AMPK的磷酸化,减弱NADPH的心肌保护作用。
结论:外源性NADPH通过激活AMPK/mTOR通路和抑制心肌细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤中发挥保护作用。NADPH可能成为预防和治疗心肌缺血性疾病的潜在靶点。