论文部分内容阅读
泡桐丛枝病是由植原体引起的一种重要的林木病害，在中国发生和分布于北至山海关，南到长江流域的广大范围内，是国内极具代表性的植原体病害，给泡桐生产造成了严重危害，具有重要的研究价值。胸苷酸激酶催化磷酰基从ATP转移到dTMP形成dTDP，是三磷酸胸苷从头合成和补救途径的关键酶。该酶广泛存在于各种生物中，是DNA合成过程中的重要限速酶，对于生物的生存必不可缺。本文对泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶基因进行了克隆、测序、多态性分析、原核表达及纯化、体外酶活性测定、对转化大肠杆菌生长和繁殖的影响以及该基因在植原体中的表达等研究，为植原体的繁殖、致病机理研究、病害治疗的新药物设计与筛选及病害综合防治等研究奠定了基础。本研究设计引物并PCR扩增了泡桐丛枝植原体河北平山株系（PaWBPs）和江西吉安株系（PaWBJan）的tmk基因，直接和克隆测定tmk序列，利用DNAMAN、MEGA等软件进行序列多样性、序列变异、蛋白功能域、系统进化等比较分析。结果表明，从PaWBPs和PaWBJan中克隆测序的93条和41条tmk-a中，分别鉴定出52和24种不同的序列，tmk-a ORF可被划分为两类，tmk-a-1为639bp，tmk-a-2为627bp，PaWBPs株系tmk-a-1与tmk-a-2序列条数的比值约为2.5，而PaWBJan株系为3.3，PaWBPs有5个相同的tmk-a-1序列与PaWBJan的一个tmk-a-1序列及枣疯植原体tmk-Y序列完全一致。因多位点突变，PaWBPs含假基因比例达48.1%，PaWBJan的为41.7%；tmk-b基因为单一序列，两株系的tmk-b核酸序列相似性为99.8%，编码蛋白仅有一个氨基酸差异。Tmk-a和tmk-b中都具有胸苷酸激酶的3个保守功能域。系统进化分析显示，泡桐丛枝植原体的两个株系的所有tmk-a序列都与枣疯植原体tmk-X和tmk-Y等聚为一个进化枝I中；而tmk-b与小麦蓝矮tmk-2等聚为另一进化枝III，基于tmk-b序列和基于16S rDNA序列构建的系统进化树一致，tmk-b有助于植原体16Sr组水平的分类，而tmk-a可用于植原体株系变异和遗传多样性分析。对从泡桐丛枝（PaWB）植原体中获得的3个预测的同源蛋白TMK-a-1、TMK-a-2及TMK-b与已报道的小麦蓝矮（WBD）、洋葱黄化（OY-W）植原体的TMK-a、TMK-b的氨基酸序列进行了比对和相似性分析，结果显示PaWBPS TMK-b与WBD TMK-2和OY-W TMK-b之间的相似性分别为95.65%和99.03%；PaWBPS TMK-a-1与PaWBPSTMK-a-2的相似性为90.57%，且二者与WBD TMK-1和OY-W TMK-a之间的相似性为87.32%-94.26%；而PaWBPS、WBD、OY-W三种植原体的TMK-a与TMK-b之间的相似性仅为22.22%-25.95%。构建了PaWBPS TMK-b、TMK-a-1、TMK-a-2的pET28a原核表达载体，对PaWBPS TMK-b、TMK-a-1、TMK-a-2三种蛋白分别进行了原核表达，经Ni-NTA柱纯化后进行了酶催化活性测定，结果表明，PaWBPS TMK-b具有较高的胸苷酸激酶活性，为85.960.74U·mg-1，而PaWBPS TMK-a-1和TMK-a-2几乎没有胸苷酸激酶活性。通过生长曲线的测定，研究了在BL21（DE3）大肠杆菌细胞中表达的PaWB TMK-a-1、TMK-a-2和TMK-b蛋白对细菌生长和繁殖的影响，结果表明，PaWB TMK-a-1、TMK-a-2和TMK-b对对数生长后期大肠杆菌的繁殖都有显著的促进作用，PaWB TMK-b对大肠杆菌繁殖的促进作用最明显，PaWB TMK-a-1和TMK-a-2次之，并且PaWB TMK-a-1和TMK-a-2对细胞繁殖的促进作用的强弱无明显差异。该研究结果也表明，体外测定无胸苷酸激酶活性的PaWB TMK-a-1和TMK-a-2可能在植原体细胞内以不同于TMK-b的方式发挥着重要功能。本研究制备了PaWB tmk-a-1、tmk-b及16S rDNA（对照）基因DNA探针，用泡桐丛枝植原体RNA在42℃和68℃杂交条件下进行的Northern blot结果显示，泡桐丛枝植原体中含有大量表达的16S rRNA；但16S rDNA探针也能从健康泡桐总RNA中检测到杂交信号；然而用PaWB tmk-a-1、tmk-b探针并未检测到PaWB tmk-a-1和tmk-b基因mRNA的杂交信号，这可能是由于tmk-a-1和tmk-b基因表达的mRNA的量很低或该基因存在尚不清楚的特殊时空表达特性导致的。另外，通过对PaWB16S rDNA与拟南芥、烟草、毛果杨等植物叶绿体16S rDNA及线粒体rRNA序列比对分析后发现，PaWB16S rDNA与这些物种的叶绿体16S rDNA序列相似性值均在70%以上，据此推测，用PaWB16SrDNA探针从健康泡桐总RNA中检测到的杂交信号很可能源于和PaWB16S rDNA高度同源的泡桐叶绿体16S rDNA或线粒体rRNA。用纯化的原核表达蛋白免疫德国大白兔，分别制备了PaWB TMK-a-1和TMK-b的多克隆抗体。对泡桐丛枝植原体蛋白进行的Western blot、FITC免疫荧光显微镜及免疫电镜结果表明，表现典型丛枝症状的泡桐组培苗体内仅检测到PaWB TMK-a-1和TMK-b蛋白微弱的表达。然而，利用PaWB TMK-a-1和TMK-b抗体从健康泡桐总蛋白中也检测到了和PaWB TMK蛋白大小相似的Western blot印迹条带，用FITC免疫荧光显微镜在健康泡桐茎部皮层细胞也观测到该蛋白特异荧光。通过对PaWB TMK-a-1、PaWB TMK-b、AtTMPK全长及来源于转录组测序的泡桐TMK蛋白的部分氨基酸序列进行的比对和抗原决定簇序列分析发现，以上4种蛋白为同源蛋白，并且它们的多个抗原决定簇序列之间有高度的相似性，据此可推测，这些高度相似的抗原决定簇可能是健康泡桐总蛋白中出现交叉血清学反应的原因。利用PaWB TMK-a-1和TMK-b抗体进行的免疫电镜表明，泡桐细胞核和叶绿体上有大量的免疫胶体金颗粒，这也从亚细胞水平揭示了健康泡桐在Western blot印迹时出现条带的原因和蛋白可能的存在部位。本研究结果也为植原体与寄主植物可能存在的内共生学说提供了有力的实验证据。tRNA-IPT基因编码的蛋白tRNA-异戊烯基焦磷酸转移酶（EC2.5.1.8）,能催化二甲烯二磷酸（DMAPP）的异戊烯基转移到前体tRNA分子反密码子附近的腺嘌呤残基上。tRNA的这种修饰能够影响蛋白质翻译的保真度及效率；这种被修饰的tRNA降解产生异戊烯基腺嘌呤，可能具有细胞分裂素活性。通过测定转化有PaWB tRNA-ipt基因的大肠杆菌生长曲线，研究了PaWB tRNA-IPT蛋白对细胞生长和繁殖的影响，结果表明，PaWBtRNA-IPT对大肠杆菌的生长和繁殖具有显著的促进作用。比较转化有tRNA-IPT和tRNA-IPT（基因内部发生了碱基突变导致tRNA-IPT蛋白的编码提前终止）的大肠杆菌生长曲线后发现，在0.25至1.0mM IPTG诱导时，转化tRNA-IPT和pET28a空载体大肠杆菌的繁殖都受到IPTG的明显抑制，而转化有tRNA-IPT的大肠杆菌的繁殖几乎未受抑制。该结果表明PaWB tRNA-IPT突变体能够克服IPTG对大肠杆菌生长的抑制作用。为了进一步研究该基因的功能，本研究成功构建了PaWB tRNA-ipt基因的植物表达载体Cam35S-GFP tRNA-IPT。用花粉管介导法进行拟南芥转化试验，对收获种子进行转化效果测定，但结果未检测到外源基因的整合。