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目的:TFEB是MiTF/TFE家族重要的转录组成因子之一,它是PI3k-Akt-mTOR信号通路上的一个下游因子,其功能活性受mTOR受体蛋白的调控,参与很多的病理生理过程,与很多疾病的发生发展密切相关,它在溶酶体功能、细胞自噬以及脂质代谢和能量代谢中有着重要作用,同时也参与细胞应激、免疫应答、细胞内清除、线粒体生物功能等过程。正常情况下,TFEB位于细胞质中,功能处于抑制状态。因为在正常功能状态下,溶酶体功能正常,溶酶体表面的Rag蛋白、GTP酶等一些小分子物质可招募mTORC1蛋白于溶酶体表面并激活mTORC1,同时这些小分子物质也会招募TFEB蛋白于溶酶体表面,在这里,具有活性的mTORC1可以使TFEB磷酸化并且失活,功能处于抑制状态,并与惰性蛋白14-3-3结合,存留于细胞质中。而在饥饿、应激、压力、溶酶体功能障碍、线粒体损伤、细菌感染等异常情况下,TFEB的功能会被激活,此时的mTORC1从溶酶体膜上释放并变的不活跃,失去对TFEB的磷酸化作用,而TFEB在相关钙离子的作用下去磷酸化并具有活性,自由进入细胞核,进行相应基因的转录,发挥相应的功能。 通过追踪大量对TFEB的研究发现,TFEB有可能是泛素连接酶Stub1的一个底物(Stub1,STIP1同源和包含U-Box区域的蛋白1,由于其C端含有与HSC70相互作用的蛋白,故又称CHIP)。E3泛素连接酶Stub1,它在底物识别和催化泛素转移以及决定泛素化底物的多样性和选择性方面具有重要作用。有文献表明,Stub1可以调节TFEB的活性,Stub1优先与磷酸化的TFEB结合并通过泛素化蛋白酶体途径使其降解,使磷酸化的TFEB与非磷酸化的TFEB之间形成的异源二聚体减少,从而使有活性的TFEB的数量和核易位增加,调节自噬转录和溶酶体的基因水平。也就是说,E3泛素连接酶Stub1可以通过调节TFEB的活性来调节细胞自噬、线粒体功能、溶酶体生物合成等其它相应的功能。但由于Stub1对TFEB的作用和降解机制还不清楚,为此进行深入的研究和探索,这是本课题主要的研究目的和内容。 VCP(Valosin-containing protein,含缬酪肽蛋白)是一种重要的Ⅱ型三磷酸腺苷(ATP)酶,一种分布很广泛的ATP酶,N端和C端主要与衔接蛋白或辅助蛋白相互作用,能结合多泛素链,负责识别底物。细胞内含量丰富且结构保守,它在内质网相关蛋白降解、自噬等途径中起着重要作用,它可将蛋白分子从蛋白质组件、内质网、细胞器膜和染色质等大细胞结构中分离出来,通过蛋白水解酶促进其降解,是蛋白质泛素化降解所必需的一种酶,存在于所有真核生物和原始细菌中。在泛素连接酶Stub1对底物TFEB降解的过程中,连接酶Stub1与结合泛素的结合酶E2结合并将泛素连接到靶蛋白TFEB上,其次Stub1需要与VCP蛋白进行结合,进而识别结合底物TFEB并转运至26s蛋白酶体上,26s蛋白酶体可特异性地识别这个带有泛素标签的底物蛋白,并将其降解。VCP蛋白目前已被证明参与多种细胞活动,包括有丝分裂、同型膜融合、内质网相关降解机制的核转录调控,并参与泛素依赖的蛋白质降解。有报道,VCP与细胞凋亡、癌症的侵袭和转移密切相关。 SVIP(small VCP/p97-interacting protein),是一种能与VCP/p97蛋白相互作用并结合的一种小分子蛋白,与极低密度脂蛋白的分泌和转运有关。有研究发现,SVIP含有能与VCP/p97蛋白结合的结构域VIM,Stub1含有可与VCP/p97蛋白结合的结构域VBM,但结构域VIM与VCP/p97蛋白的结合作用强于结构域VBM,也就是说结构域VIM可以优先与VCP/p97蛋白结合并对结构域VBM形成竞争性抑制。从理论上讲,SVIP可以竞争性抑制Stub1与VCP/p97蛋白的结合,抑制Stub1对TFEB蛋白的降解作用,但具体结果还需要进行研究与验证。 因此,如果能阐明Stub1对TFEB的作用和降解机制以及SVIP是否可以抑制这种作用,那么就可以从多方面对TFEB的活性与功能、合成与降解进行调控,从而实现相应的目的。于是对Stub1与它的其它一些底物作用和降解的机制进行研究,发现了与这些底物作用的功能结合域,进而分析可能与TFEB结合和作用的功能结构域,并构建缺失这些功能域的TFEB突变体,观察Stub1对TFEB野生体和突变体的作用,探讨Stub1对TFEB的作用和降解机制,为TFEB的调控提供新的理论基础,为疾病的治疗和科学研究提供新的思路和方法。 方法:(1)通过序列比对及分子生物学软件查找出TFEB上可能与Stub1结合的氨基酸序列。(2)运用定点突变技术构建TFEB的突变体TFEB-Mutation,通过RT-PCR技术对突变结果进行筛选和鉴定。(3)利用Western blot技术和免疫荧光显微共聚焦技术观察TFEB野生体和突变体在细胞中的表达情况。(4)利用Western blot技术和免疫共沉淀技术检测Stub1对TFEB野生型和突变型的作用和结合情况。(5)应用放线菌酮实验和泛素化检测观察Stub1对TFEB野生型和突变型的降解情况和泛素化作用。 结果:(1)通过序列比对及分子生物学软件查找到TFEB上可能与Stub1结合的氨基酸序列。(2)运用定点突变和RT-PCR检测技术构建出TFEB突变体TFEBΔ(218-250)(Mut1)和TFEBΔ(176-246)(Mut2)。(3)通过Western blot和免疫荧光结果观察到TFEB突变体与TFEB野生体都能够稳定地在细胞中表达,并能与Stub1共同在细胞内表达且大多共定位在细胞核中,一部分共定位在细胞质中,这为后续的实验观察提供基础。(4)Western blot和免疫共沉淀结果显示Stub1对TFEB具有作用以及对TFEB野生型和突变型具有不同的结合情况,Stub1对野生型的TFEB具有明显的结合作用,而对突变型TFEBΔ(218-250)(Mut1)和TFEBΔ(176-246)(Mut2)仅有较弱的结合作用或没有作用。(5)放线菌酮实验和泛素化检测证实Stub1可以使野生型和突变型的TFEB泛素化,并且降解,但是降解作用的程度不同,对野生型的作用强于Mut1,对Mut2几乎没作用。 结论:TFEB是Stub1的一个底物,Stub1对TFEB具有结合、泛素化和降解的作用,Stub1对野生型TFEB具有明显的结合和泛素化降解作用,而对突变型TFEBΔ(218-250)(Mut1)和TFEBΔ(176-246)(Mut2)仅有较弱的作用或没有作用,这说明,Stub1通过作用于TFEB特定的结合域而发挥相应的功能,这是Stub1作用于TFEB的基础,也是Stub1降解TFEB的重要机制。同时还证明了SVIP可以竞争性抑制Stub1对TFEB的降解,这为TFEB多方面的调控及机体功能的调节提供依据,也为一些疾病的治疗和科研探索提供新的治疗靶点和研究进展。