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研究背景肺癌是全球范围内肿瘤相关性死亡的首要原因,也是严重危害我国人民健康的重大疾病之一,最常见的病理类型为非小细胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer,NSCLC)。近年来,针对驱动基因突变的分子靶向治疗,虽使部分晚期患者取得了生存获益,但最终都不可避免地发生耐药,患者的预后仍不乐观。研究证实,肿瘤在发生发展过程中,与肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)存在着密不可分的关系,两者之间的相互作用不断推动了肿瘤的转化、进展。因此,TME逐渐成为肿瘤研究领域的热点之一。从TME的角度深入探究NSCLC发生发展的分子机制,寻找新的治疗靶点,阻断肿瘤增殖、侵袭转移的途径,对改善NSCLC的预后具有十分重要的意义。Angptl2(Angiopoietin-likeprotein2,血管生成素样蛋白2)是一种分泌性糖蛋白,结构与血管生成素类似,在炎症反应中发挥重要作用,维持组织稳态。此外,Angptl2被发现在多种肿瘤(包括NSCLC)中高表达,通过多个方面,如促进肿瘤细胞侵袭迁移及肿瘤组织血管生成等,促进肿瘤生长转移,是患者预后不良的标志之一。既往关于Angptl2对肿瘤进展的影响集中于对肿瘤细胞本身或血管生成的作用,而Angptl2作为分泌性因子,其对TME中间质细胞的调控作用尚不明确。TME由肿瘤细胞、多种免疫细胞、血管和淋巴管内皮细胞以及细胞外基质等构成。这些细胞之间通过生长因子、促血管生成因子、趋化因子等介质相互作用,直接或间接地影响彼此的生物学功能,促进肿瘤的增殖、侵袭、远处转移等恶性生物学行为,为肿瘤的生存和发展创造最有利的条件。骨髓来源的细胞(bone marrow-derived cells,BMCs)是TME中最主要的间质细胞,大约占实体瘤细胞总量的15～20%,而其中含量最多的是肿瘤相关性巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)。机体组织中的巨噬细胞具有表型可变和功能多样的重要特征。在不同环境刺激下,巨噬细胞可极化为具有不同分子和功能特征的两个亚型:M1型(经典活化)和M2型(替代性活化)。M1表型特点为白介素(interleukin,IL)12high、IL23high、IL-10low,分泌一氧化氮、炎性因子等,发挥抗肿瘤效应;M2表型特点为IL-10high、IL12low、IL23low,激活组织修复程序、血管生成和抑制适应性免疫反应等,促进肿瘤发展;二者在一定条件下相互转化,影响着肿瘤及其他免疫相关疾病的发展过程。TAMs受微环境中多种细胞及细胞因子的调节,也存在M1样(抗肿瘤效应)和M2样(促肿瘤效应)功能表型,如何减少TAMs向M2样极化已成为肿瘤治疗的一个“魅力靶点”。本研究分为三部分:①探究Angptl2对TAMs极化表型的影响及其分子通路机制;②探究Angptl2诱导的TAMs对NSCLC细胞生物学行为的影响;③Angptl2通过TAMs对裸鼠体内NSCLC移植瘤生长的影响。首次从调控TAMs的角度探究Angptl2促NSCLC进展的机制,为通过调控TAMs表型治疗NSCLC提供理论依据。研究目的1.明确原发性NSCLC肿瘤组织中Angptl2的表达,及其与相关病理参数的关系,明确Angptl2对NSCLC患者预后的影响;2.明确Angptl2对TAMs功能表型的调控作用;3.明确Angptl2调控巨噬细胞极化的分子通路机制;4.明确Angptl2诱导的巨噬细胞对NSCLC细胞增殖、侵袭迁移等生物学行为的影响;5.明确裸鼠体内NSCLC移植瘤中,Angptl2是否通过TAMs发挥作用。研究方法第一部分1.通过免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)检测 Angptl2 在 NSCLC组织及癌旁肺组织中的表达;分析Angpt12在NSCLC组织中的表达与患者临床病理参数之间的相关性;收集NSCLC患者的预后随访资料,应用Kaplan-Meier法分析Angptl2的表达与NSCLC患者总生存之间的关系。2.通过IHC检测巨噬细胞标志分子CD68、血管内皮细胞标志分子CD34的表达,分析Angptl2的表达与TAMs浸润和微血管密度(microvessel density,MVD)的相关性。3.通过Western blot检测Angptl2在5株NSCLC细胞系及正常肺上皮细胞中的表达。选择内源性低表达者H1299转染Angptl2过表达质粒,选择内源性高表达者A549转染Angpt12 shRNA质粒。4.通过佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导人单核细胞系 THP-1,得到分化的巨噬细胞。5.分别将过表达及敲除 Angptl2 的 NSCLC 细胞(H1299-MOCK/H1299-Angptl2,A549-shNC/A549-shAngptl2)与THP-1源性巨噬细胞共培养,通过流式细胞术检测共培养后M2型巨噬细胞(CD206+,CD209+)的比例。6.采用人Angpt12重组蛋白(rAngptl2)作用于THP-1源性巨噬细胞,利用RT-PCR检测巨噬细胞M1(TNF-α、IL-12)和M2(IL-10、Argl)分型分子标志mRNA表达的变化。7.采用rAngptl2作用于THP-1源性巨噬细胞,利用western blot检测巨噬细胞极化相关通路关键蛋白的磷酸化,进一步利用通路抑制剂进筛选下游通路。第二部分1.采用人重组蛋白Angptl2作用于THP-1源性巨噬细胞,western blot检测巨噬细胞中促肿瘤因子VEGF-A、MMP-9和TGF-β的蛋白表达。2.为探究Angptl2诱导的巨噬细胞对NSCLC细胞生物学行为的影响,取rAngptl2刺激巨噬细胞24h的上清作条件培养基,对照组为:等量PBS作用于巨噬细胞24h的上清;rAngptl2+完全培养基。3.CCK8实验检测3组条件培养基对NSCLC细胞增殖的影响。4.划痕愈合实验检测3组条件培养基对NSCLC细胞迁移的影响。5.Transwell侵袭实验检测3组条件培养基对NSCLC细胞侵袭的影响。6.小管形成实验检测3组条件培养基对HUVEC细胞成管能力的影响。7.Transwell迁移实验检测3组条件培养基对HUVEC细胞迁移能力的影响。第三部分1.通过慢病毒感染和筛选获得稳定过表达Angptl2的NSCLC细胞株H1299-Angptl2 和对照细胞株 H1299-MOCK。2.构建BALB/c Nude裸鼠皮下移植瘤模型。3.分为 4 组:H1299-MOCK,H1299-Angptl2,H1299-Angptl2+CCL(clophosome-clodronate liposomes,氯膦酸二钠脂质体):种植移植瘤后的第一周起,每3天向裸鼠尾静脉注射内氯膦酸二钠脂质体,使巨噬细胞凋亡,H1299-Angptl2+CNL(control neutral liposomes,对照脂质体):尾静脉注射对照脂质体。4.每周测量皮下移植瘤长短径,计算体积,5周后引颈处死,称重。5.观察Angptl2对NSCLC移植瘤生长的影响。6.IHC检测注射CCL组巨噬细胞(F4/80+)的密度,以验证巨噬细胞清除模型是否成功。7.观察Angptl2在巨噬细胞凋亡的情况下对NSCLC移植瘤生长的影响。研究结果第一部分1.Angptl2在NSCLC组织中高表达且与病人不良预后相关IHC结果显示,Angptl2在原发性NSCLC组织中高表达,阳性表达率为71.6%(58/81),主要表达于肿瘤细胞的细胞质,癌旁肺组织亦有Angptl2表达,阳性表达率为29.6%(16/54),Angptl2在NSCLC肿瘤组织中的表达与原发肿瘤大小(P=0.022)和TNM分期(P=0.037)呈正相关;高表达Angptl2组患者的总生存率显著低于低表达组。2.Angptl2与TAMs浸润和MVD的关系Pearson相关系数法分析显示,原发性NSCLC组织中Angptl2的表达与TAMs浸润和MVD呈明显正相关(r=0.5848;r=0.2399)。3.Angptl2在NSCLC细胞中高表达Western blot结果示:Angptl2在所检测的5株NSCLC细胞系(A549、H226、H1299、H1650及H1975)中均存在表达,其中H1650和H1299属低表达细胞系,而A549、H226和H1975为高表达细胞系,均高于正常肺上皮细胞BEAS-2B中的表达。4.Angptl2诱导TAMs M2样极化流式细胞术检测显示,H1299-Angptl2细胞与巨噬细胞共培养,M2型TAMs比例高于对照组,A549-shAngptl2与巨噬细胞共培养,M2型TAMs比例低于对照组。高浓度(50ng/ml)rAngptl2作用于巨噬细胞,RT-PCR检测显示M2型巨噬细胞分子标志mRNA表达升高,M1型巨噬细胞分子标志mRNA表达无显著变化。(此部分与肿瘤细胞共培养的巨噬细胞标为TAMs)5.Angpt12通过p65 NF-κB信号通路诱导巨噬细胞M2型极化50ng/ml rAngptl2刺激THP-1源性巨噬细胞,western blot检测显示Stat6和p65 NF-κB的磷酸化水平增高,分别加入通路抑制剂筛选,p65 NF-κk信号通路被抑制后,巨噬细胞M2型标志物mRNA表达上调被明显抑制。第二部分1.Angptl2诱导巨噬细胞促肿瘤因子的表达Western blot结果显示,rAngptl2诱导后的巨噬细胞,VEGF-A、MMP-9和TGF-p蛋白表达升高。2.Angptl2诱导的巨噬细胞对NSCLC细胞生物学行为的影响CCK8、划痕愈合实验和Transwell侵袭实验结果显示,Angptl2诱导的巨噬细胞明显增强NSCLC细胞的增殖、侵袭及迁移能力,且其促进能力明显高于Angptl2蛋白本身的促进能力。3.Angptl2诱导的巨噬细胞对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)生物学行为的影响小管形成实验和Transwell迁移实验结果显示,Angptl2诱导的巨噬细胞明显增强HUVEC细胞的成管和迁移能力,且其促进能力明显高于Angptl2蛋白本身的促进能力。第三部分1.Angptl2促进NSCLC移植瘤的生长H1299-Angptl2组小鼠移植瘤体积和重量明显高于对照组H1299-MOCK,IHC结果显示,H1299-Angptl2组TAMs浸润密度和MVD高于H1299-MOCK组。2.TAMs影响Angptl2的促肿瘤作用尾静脉注射CCL后,IHC检测显示移植瘤组织中TAMs明显减少;此时,虽然肿瘤细胞高表达Angpt12,其对移植瘤的生长无明显促进作用。结论1.Angpt12在人原发性NSCLC组织中高表达,且Angptl2的表达与NSCLC患者不良预后相关。2.Angptl2 诱导 TAMs M2 样极化。3.Angptl2通过p65 NF-κB信号通路诱导巨噬细胞M2型极化。4.Angptl2诱导的巨噬细胞分泌多种促肿瘤细胞因子。5.Angptl2诱导的巨噬细胞促进NSCLC细胞增殖、侵袭迁移能力,以及HUVEC细胞的迁移和成管能力,且明显高于Angptl2蛋白本身的促进作用。6.Angptl2通过TAMs促进NSCLC移植瘤在裸鼠体内的生长。