前言乳腺癌是严重威胁女性身心健康的恶性肿瘤之一,而乳腺癌的复发和转移是影响其疗效的主要因素。因此,迫切需要寻找一个敏感性好且能较早预测乳腺癌转移的分子生物学标记物及能够抑制其迁移运动和转移的治疗靶点,为临床对乳腺癌的复发和转移做出早期预测提供一定的参考依据,从而有助于及时采取更加有效的治疗措施。缺氧是包括乳腺癌在内的恶性实体瘤发展过程中普遍存在的现象。为了适应或克服缺氧环境,肿瘤组织内部会发生一系列包括无氧代谢增加、细胞凋亡抑制、新生血管形成、肿瘤局部浸润和转移能力增强等在内的缺氧反应。缺氧反应通过缺氧诱导因子HIF-1 α来启动和调节,从而形成一系列由HIF-1 a介导的缺氧反应调控通路,其下游CA Ⅸ被认为是一种可靠的缺氧标记物,不仅能调节细胞酸碱平衡、介导细胞间信息交流,还与细胞黏附以及肿瘤的恶性进展关系密切。本课题试图从人乳腺癌组织和人乳腺癌细胞株两方面对缺氧标记物CAⅨ在乳腺癌中的表达及其与乳腺癌侵袭转移的相关性进行研究,以探讨CAⅨ的表达与乳腺癌侵袭转移及预后的相关性,探索CAⅨ是否可作为临床上一个独立的有预后意义的分子指标及预测人乳腺癌转移的分子生物学标记物,为临床对乳腺癌的侵袭转移做出早期预测提供一定的参考依据,从而有助于及时采取更加有效的治疗措施,并且为乳腺癌CAⅨ分子靶向治疗提供新的佐证。故该课题的研究不仅对了解肿瘤的生物学特性具有明显的理论意义,也具有潜在的临床价值和社会效益。第一部分 人乳腺癌组织CA Ⅸ的表达及其与临床参数的关系目的 阐明人乳腺癌组织中CA Ⅸ的表达情况及其与临床参数(包括预后)的关系。方法采用免疫印迹(Western blot)的方法检测11例人乳腺癌组织及对应正常组织中CA Ⅸ的表达情况；采用IHC的方法在149例人乳腺癌组织标本中研究CA Ⅸ的表达及其与临床参数(包括预后)的关系。结果 11例乳腺癌组织及对应的正常组织经Western blot方法检测CAⅨ蛋白表达水平,结果提示CAⅨ蛋白在部分乳腺癌组织中高表达,而在乳腺正常组织中几乎不表达或低表达,CAⅨ蛋白在乳腺癌组织中的表达显著高于正常乳腺组织(p<0.001)；IHC的结果显示,CA Ⅸ蛋白的表达主要定位于细胞膜；在149例乳腺癌标本中,22例样本中的癌细胞CAⅨ表达阳性,阳性率为14.77%；CAⅨ的表达与肿瘤大小(p=0.019)、淋巴结转移(p=0.006)、远处转移(p<0.001)和临床分期(p=0.003)具有显著的相关性；149例人乳腺癌组织的Kaplan-Meier生存分析揭示,CAⅨ的高表达与乳腺癌患者较短的生存期之间有显著的相关性(χ2=41.080,p<0.001)；单、多因素生存分析显示CAⅨ蛋白在乳腺癌患者预后分析中是一个独立的有预后意义的分子指标(p< 0.001, HR= 5.758,95% CI:2.286-14.502)。小结CA Κ蛋白在部分乳腺癌组织中高表达,而在乳腺正常组织中几乎不表达或低表达,CA Ⅸ蛋白在乳腺癌组织中的表达显著高于正常乳腺组织；CAⅨ蛋白与肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移、临床分期及生存期具有显著相关性；缺氧标记物CAⅨ蛋白在乳腺癌患者预后分析中是一个独立的有意义的分子指标。第二部分 COCl2诱导的CA Ⅸ表达对人乳腺癌细胞迁移和侵袭转移的影响目的 明确缺氧诱导的CAⅨ表达变化及其对人乳腺癌细胞迁移和侵袭转移的影响。方法选用两株人乳腺癌细胞(高侵袭性的乳腺癌细胞MDA-MB-231、低侵袭性的乳腺癌细胞MCF-7),利用COCl2模拟缺氧环境来建立缺氧模型。实验细胞分为对照组和缺氧组,细胞同步化24小时后,对照组细胞培养于含10%FBS的DMEM培养基中,缺氧组细胞培养于含CoC12终浓度为200μmol/L的缺氧诱导培养基中,两组均在37℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度培养箱中培养24、48、72小时；采用Western blot的方法检测细胞HIF-1 a和CAⅨ蛋白的表达变化；采用Transwell迁移实验研究其体外迁移运动能力的变化；采用1ranswell侵袭实验研究其体外侵袭运动能力的变化。结果 体外实验表明,与对照组相比,缺氧组细胞经200μmol/L CoCl2处理24h、48h、72h后HIF-1 α蛋白的表达均有所上调；经CoCl2处理24h、48h后,CAⅨ蛋白的表达量下降,但差异没有统计学意义,处理72h后,CA Ⅸ的蛋白表达显著上调；COCl2作用24h后,与对照组相比,缺氧组细胞体外迁移运动和侵袭能力下降,作用72h后,与对照组相比,缺氧组细胞体外迁移运动和侵袭能力明显提高。小结 CoCl2诱导的化学缺氧能有效上调HIF-1α和CAⅨ的表达；缺氧诱导的CAⅨ表达上调要滞后于HIF-1 α表达的上调,且HIF-1 α表达的上调在缺氧早期较缺氧后期更为明显；高表达CAⅨ在体外能促进人乳腺癌细胞的迁移运动、侵袭转移潜能。